Transgene Redoxindikator-Mäuse mit mitochondrialer roGFP1-Expression: Phänotypisierung, neuronales Verteilungsmuster und Sensorfunktionalität

Transgene Redoxindikator-Mäuse mit mitochondrialer roGFP1-Expression: Phänotypisierung, neuronales Verteilungsmuster und Sensorfunktionalität

Transgenic redox indicator mice expressing mitochondrial roGFP1: phenotypic characterization, neuronal expression pattern and sensor functionality

Kerstin Charlotte Wagener

Doctoral thesis

Date of Examination: 2017-12-06

Date of issue: 2017-12-05

Advisor: Müller, Michael Prof. Dr.

Referee: Müller, Michael Prof. Dr.

Referee: Jakobs, Stefan Prof. Dr.

Persistent Address: http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0023-3F99-F

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Abstract

English

Reactive oxygen spezies (ROS) and redox alterations determine not only physiological signaling but also lead to oxidative stress, cellular dysfunction and a wide range of pathologies. A major source of ROS-generation is the mitochondrial respiratory chain. For detailed assesment of ROS and redox changes reliable redox probes are an essential need. We now established transgenic mice stably expressing the redox indicator protein roGFP1 (reduction oxidation sensitive green fluorescence protein) in neuronal mitochondria under the Thy1.2-promotor (C57BL/6-TG (Thy1.2-roGFP1m). Negative side effects of the transgen could be excluded by detailed phenotypic analyzes and behavior testing. Measurements with conventional fluorescence microscopy and 2-photon-laser-scanning-microscopy confirmed a strong expression pattern of roGFP1 in mitochondrial matrix almost throughout the central nervous system. Neuron-specific expression of mitochondria-targeted roGFP1 was confirmed by anti-NeuN-antibody counterlabeling. Mitochondria-specific expression was shown by Mitotracker 580 Red- labeling. Functional tests and response range calibrations on acute brain slices verified the full responsiveness of the rationmetric redox probe and showed an oxidized environment in mitochondrial matrix. Mitochonrial redox status in brain tissue can now be assessed during development and aging. Cross breeding of mito-roGFP1-mice with various mouse models for neuronal deseases will unveil the generation of ROS, the mitochondrial redox system and its contribution in pathogenesis and desease progression.

Keywords: roGFP1, transgenic mice, mitochondria, redox-imaging, ROS, oxidative stress

German

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die hauptsächlich in den Mitochondrien entstehen, determinieren in wesentlichem Ausmaß den feinregulierten Redoxstatus der Zelle und beeinflussen dadurch sowohl physiologische Signalfunktionen als auch die Entstehung von oxidativem Stress und (neuro)degenerativen Prozessen. Zum Verständnis komplexer Redoxsysteme ist die Entwicklung verlässlicher Redoxindikatoren unerlässlich. Proteinbasierte Redoxsensoren konnten sich in den letzten Jahren zum Goldstandard der Redoxmessung durchsetzen, da sie anders als beispielsweise redoxsensitive Farbstoffe ein reversibles Antwortverhalten zeigen und verlässliche und quantitative Aussagen auf zellulärer und subzellulärer Ebene zulassen. Im Gegensatz zu aufwendigen Transfektions- und viralen Transduktionsverfahren zum Einschleusen der Sensor-DNA in das gewünschte Gewebe, die die Versuche auf kultivierbare, neonatale Zellen limitierten, ermöglichen transgene Tiermodelle Redoxmessungen an adultem und komplexerem Gewebe. Im Rahmen meiner Arbeit habe ich ein transgenes Mausmodell mit stabiler in vivo-Expression des grün fluoreszierenden Redoxindikatorproteins roGFP1 unter der Kontrolle des Thy1.2-Promotors in den neuronalen Mitochondrien (C57BL/6-TG (Thy1.2-roGFP1m) charakterisiert. Ausgiebige Analysen von Entwicklung und Verhalten konnten einen negativen Einfluss des Transgens auf die Tiere klar ausschließen. Mittels klassischer Fluoreszenzmikroskopie und detaillauflösender 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie konnte die Thy1.2-gesteuerte Expression des fluoreszierenden Proteins in weiten Teilen des Gehirns, dem Rückenmark und besonders deutlich dem Hippokampus, Kortex und Kleinhirn nachgewiesen werden. Zum Nachweis der Neuronenspezifität wurde eine immunhistochemische Gegenfärbung an PFA-fixierten Hirnschnitten mit dem fluoreszenzmarkierten Anti-NeuN-Antikörper durchgeführt. Die Mitochondrienspezifität wurde mit einer Mitotracker 580 Red - Gegenfärbung belegt. Im Rahmen ratiometrischer Redoxmessungen an akuten Hirnschnitten regierte der Sensor dynamisch und in Echtzeit auf Reduktion und Oxidation. Für die mitochondriale Matrix wurden deutlich oxidierte Baseline-Ruhewerte ermittelt, wobei die CA3-Region des Hippokampus sich dabei stärker oxidiert zeigte als andere hippokampale und kortikale Areale. Auch endogen hervorgerufene Redoxänderungen durch pharmakologisches Eingreifen in den mitochondrialen ROS-Stoffwechsel konnten vom roGFP1 erfasst und widergegeben werden. Ein Einkreuzen der mitochondrialen roGFP1-Maus in Mausmodelle für neuronale Erkrankungen sollte sich in naher Zukunft als vielversprechende Methode erweisen, die Entstehung von ROS, Änderungen des mitochondrialen Redoxstatus und deren mögliche Beteiligung an Pathogenese und Krankheitsprogression zu ermitteln.

Schlagwörter: roGFP1, Mausmodell, Mitochondrien, Redoxmessung, ROS, oxidativer Stress