A scanning ion conductance microscopy assay to investigate interactions between cell penetrating peptides and pore-suspending membranes
by Christoph Saßen
Date of Examination:2013-10-22
Date of issue:2014-10-10
Advisor:Prof. Dr. Claudia Steinem
Referee:Prof. Dr. Claudia Steinem
Referee:Prof. Dr. Ulf Diederichsen
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Name:Dissertation_csassen.pdf
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Format:PDF
Abstract
English
Scanning ion conductance microscopy (SICM) provides a technique for the investigation of surface topography as well as the local ion conductance of a surface without any mechanical contact between probe and sample. This avoidance of interaction is particularly advantageous for the examination of highly flexible structures such as lipid membranes, e.g. living cells or artificial membranes. Pore-suspending membranes (PSMs) as a model system combine high stability with close mimicking of natural structures with respect to lateral mobility and the existence of aqueous compartments on both sides of the bilayer. A major field of research focuses on the interaction of lipids or other membrane constituents with peptides, in recent years notably cell penetrating peptides (CPPs). Among most prominent examples are melittin as the major venom component of the honey bee Apis mellifera and penetratin as the third helix of the Drosophila melanogaster Antennapedia homeodomain. Generalised protocols for the preparation of solvent-free PSMs are reported. Giant unilamellar vesicles (GUVs) of various lipid compositions were spread on porous silicon nitride (Si3N4) substrates which had been functionalised with cholesterylpolyethylenoxy thiol (CPEO3, hydrophobically) or with mercaptoethanol (ME, hydrophilically). Lipid compositions comprised purely zwitterionic phosphatidylcholine (PC) lipids as well as mixtures of PC lipids with cholesterol and PC lipids with phosphatidylserine (PS) lipids. Successful spreading was proven by means of confocal laser scanning microscopy (CLSM) and SICM imaging. The main part of this thesis dealt with the development and application of CPP titration assays based on both the CLSM and SICM techniques aiming at the elucidation of the influence of substrate functionalisation and membrane composition on interactions of melittin and penetratin with PSMs. The CLSM assay was performed with melittin on PSMs of every lipid composition on both hydrophobically and hydrophilically functionalised substrates and with penetratin on PSMs of every lipid composition on hydrophilically functionalised substrates. Rupturing of bilayers on hydrophilically functionalised substrates was observed at comparable concentrations of 1–3 µM for both peptides. Comparison of experiments on hydrophilically and hydrophobically functionalised substrates reveals three times higher melittin concentrations in the former case. On both functionalisation types, a cholesterol content of 10% resulted in an increase in melittin concentration sufficient for membrane rupturing, while 20% PS lipids resulted in a decrease. SICM experiments were performed with melittin on PC/cholesterol PSMs on hyrophobically and on hydrophilically functionalised substrates as well as with pure PC PSMs on hydrophilically functionalised substrates. There was not any significant difference found for membrane rupturing inducing peptide concentrations. These were of the same order as found in CLSM experiments. Prior to rupturing, an increase in pore depth hinting at an increase in membrane permeability was observed.
Keywords: scanning ion conductance microscopy; SICM; pore-suspending membranes; membrane model system; cell penetrating peptide; CPP; melittin; penetratin
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Die Rasterionenleitfähigkeitsmikroskopie (scanning ion conductance microscopy, SICM) stellt eine kontaktfreie Methode zur Ermittlung sowohl der Topographie als auch lokalen Ionenleitfähigkeit einer Oberfläche dar. Besonders vorteilhaft ist die Vermeidung mechanischer Beeinflussung bei der Untersuchung flexibler Strukturen, z.B. Lipiddoppelschichten wie Zellen oder künstlich erzeugter Lipidmembranen. Porenüberspannende Membranen (pore-suspending membranes, PSMs) verbinden als ein Beispiel für Modellsysteme eine hohe Stabilität mit lateraler Mobilität und dem Vorhandensein wässriger Kompartimente ober- und unterhalb der Doppelschicht, wie sie auch in der Natur gefunden werden. Ein wichtiges Forschungsgebiet stellt die Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden, besonders zellpenetrierenden Peptiden (cell penetrating peptides, CPPs), mit Lipiden und anderen Membranbestandteilen dar. Häufig untersuchte Beispiele sind Melittin, Hauptbestandteil des Giftes der Honigbiene Apis mellifera, sowie Penetratin, dritte Helix der Antennapedia Homöodomäne von Drosophila melanogaster.
Generalisierte Protokolle zur Herstellung lösungsmittelfreier PSMs werden vorgestellt. Riesige unilamellare Vesikel (giant unilamellar vesicles, GUVs) unterschiedlicher Lipidzusammensetzung wurden hierzu auf porösem Siliziumnitrid (Si3N4), welches mit Cholesterylpolyethylenoxythiol (CPEO3, hydrophob) bzw. Mercaptoethanol (ME, hydrophil) funktionalisiert worden war, gespreitet. Verwendet wurden GUVs aus reinen Phosphatidylcholin (PC)-Lipiden sowie aus Mischungen von PC-Lipiden mit Cholesterol und PC-Lipiden mit Phosphatidylserin (PS)-Lipiden. Der Erfolg des Spreitvorgangs wurde durch Abbilden mittels konfokaler Rasterlasermikroskopie (confocal laser scanning microscopy, CLSM) und SICM verifiziert.
Der Hauptteil dieser Arbeit behandelte die Entwicklung und Anwendung CLSM- und SICM-basierter CPP-Titrationsassays zur Aufklärung des Einflusses der Substratfunktionalisierung und der Lipidzusammensetzung der Membranen auf die Wechselwirkung zwischen Melittin bzw. Penetratin und den Lipiddoppelschichten. CLSM-Experimente wurden mit Melittin auf allen zur Verfügung stehenden PSMs sowohl auf hydrophob als auch hydrophil funktiona-lisierten Substraten durchgeführt, während Penetratin auf den drei unterschiedlichen PSMs auf hydrophil funktionalisierten Substraten verwendet wurde. Ein Reißen der Membranen wurde im Fall hydrophil funktionalisierter Substrate für beide Peptide im Bereich von 1–3 µM beobachtet. Bei hydrophob funktionalisierten Substraten induzierte eine dreifach geringere Melittinkonzentration die Zerstörung der Membranen. Sowohl auf hydrophob als auch auf hydrophil funktionalisierten Substraten wurde bei einem Cholesterolanteil von 10% eine Erhöhung der zum Reißen notwendigen Melittinkonzentratin erhalten, während bei 20% PS-Anteil eine Verschiebung zu geringeren Konzentrationen evident wurde. SICM-Experimente wurden mit Melittin auf PC/Cholesterol-PSMs auf hydrophob und hydrophil funktionalisierten Substraten und mit reinen PC-PSMs auf hydrophil funktionalisierten Membranen durchgeführt. Es wurden keine signifikanten Konzentrationsunterschiede beobachtet; die gefundenen Konzentrationsbereiche jedoch stimmten mit denen der CLSM-Experimente überein. Darüberhinaus wurde vor dem Reißen der Membranen ein Ansteigen der Porentiefe gefunden, das mit einer erhöhten Membranpermeabilität korrespondiert.