Nitrous oxide from fungal denitrification - Pure culture and soil studies using stable isotope and microbial inhibitor approaches
by Lena Rohe
Date of Examination:2014-05-22
Date of issue:2014-12-17
Advisor:PD Dr. Reinhard Well
Referee:Prof. Dr. Nicole Wrage-Mönnig
Referee:Prof. Dr. Klaus Dittert
Referee:Prof. Dr. Heinz Flessa
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-4829
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Abstract
English
The trace gas nitrous oxide (N2O) contributes to climate change as well as to the depletion of the ozone layer in the stratosphere. Agricultural soils account for about 70% of the high anthropogenic N2O emissions. Microbial processes in soil use, for instance fertilizer N to produce N2O, are an important factor. An understanding of N2O production pathways is imperative to evaluate reliable mitigation methods for N2O emissions. The present study focused on denitrification, which, besides nitrification and nitrifier denitrification, is one of the main N2O production pathways in soils. Denitrification describes the reduction from nitrate (NO3-) to N2, with nitrite (NO2-), nitrous monoxide (NO) and N2O as intermediates. For a long time denitrification was attributed only to heterotrophic bacteria. In 1972, however, pure culture studies showed that fungi are also capable of denitrification, and two decades later most fungi were found to lack the N2O reductase, resulting in N2O being the main product of fungal denitrification instead of N2. This could indicate that fungi might produce more N2O compared to bacteria, providing that both groups have the same production rates. However, the contribution of different microbial groups to N2O emissions from soil has not yet been sufficiently investigated. Analysis of the isotopic signature of N2O found this to be a promising tool to distinguish between N2O produced by different microbial groups. Especially the site preference of 15N in N2O (SP = difference between δ15N of the outer and central N atoms in N2O) from denitrification revealed differences between pure bacterial cultures (SP = -11 to 0 ‰) and two studied pure fungal cultures (SP ~ 37 ‰). Although it is known that all enzymes involved in fungal denitrification, with the exception of the N2O reductase, equals the enzymes of bacteria, most denitrification studies with pure cultures covered the bacterial pathway. The different N2O reductases might be the reason for different SP of N2O produced by bacteria or fungi. An O exchange between denitrification intermediates and water between 4 and 100% was found during bacterial denitrification, while there has been no study analyzing the existence of O exchange during fungal denitrification so far. If O exchange were not to occur during fungal denitrification, this could provide an additional ability to differentiate between N2O produced by fungi or bacteria. The O isotopic signature of N2O produced by fungi would significantly differ from that produced by bacteria. The present study focused on three subjects. With an isotope tracer experiment with 18O labeled water, the existence of O exchange between denitrification intermediates and water during denitrification was studied with six fungal species. The fungi showed an O exchange of up to 100% and consequently a differentiation between fungal and bacterial denitrification with an O isotopic signature is impossible. The second subject was verification of the high SP values of N2O from fungal denitrification in four additionally tested species and consideration of whether it was reproducible for the two tested species known from literature. This study confirmed higher SP values of N2O (SP = 19.7 to 31.7 ‰) compared to the SP of N2O known from bacteria. Based on the results of the isotope tracer experiment and the O isotopic signature of N2O under natural conditions, mechanisms of the O isotope fractionation were analyzed by applying values of fractionation effects known from the literature in an isotope fractionation model to estimate the involved enzymes on O exchange during denitrification. The O exchange of NO2- reductase was high compared to O exchange of NO3- and NO reductases. The knowledge obtained from pure fungal culture studies was used in Subject Three to test the transferability to microbial communities in soils by using microbial inhibitors for bacteria or fungi in soil incubation experiments. A modification of substrate induced respiration with selective inhibition (SIRIN) was used to determine whether the specific SP values of N2O known for bacteria and fungi are measurable after selective growth inhibition by specific antibiotic application. The expected effect of growth inhibition on SP of N2O was not found. In most cases the SP of N2O was in the range known from pure bacterial cultures and bacterial growth inhibition did not result in the expected shift of SP values. Consequently the SP values of this incubation experiment did not serve to associate the N2O production in inhibited treatments to different microbial groups. It remained unclear if this was due to the modified SIRIN method or if transferability of differences in SP of N2O known from fungi and bacteria on a microbial community in soil is possible. Future studies should approach the existing problems regarding the methods to identify fungal denitrification in soil.
Keywords: 18O isotope tracer; N2O isotopologues; selective growth inhibition; 15N site preference
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Das Spurengas Lachgas (N2O) trägt zur Klimaerwärmung und Zerstörung der Ozonschicht in der Atmosphäre bei. Mit einem Anteil von ca. 70% sind landwirtschaftliche Böden weltweit Hauptverursacher der hohen anthropogenenN2O Emissionen. N2O entsteht in Böden durch verschiedene mikrobiologische Prozesse, bei denen N2O unter anderem aus düngerbürtigem N gebildet wird. Die Entwicklung effektiver Minderungsmaßnahmen wird erst möglich, wenn ein Verständnis der N2O Quellprozesse und ihrer Dynamik in Böden vorhanden ist.
In dieser Studie wurde die Denitrifikation als ein Quellprozess untersucht, der zusammen mit Nitrifikation und Nitrifizierer-Denitrifikation hauptsächlich für die N2O Emissionen aus Böden verantwortlich ist. Die Denitrifikation beschreibt die Reduktion von Nitrat (NO3-) zu N2, wobei Nitrit (NO2-), Stickstoffmonoxid (NO) und N2O Zwischenprodukte dieses Reaktionsweges sind. Lange Zeit galten heterotrophe Bakterien als alleinige Verursacher von N2O Emissionen aus der Denitrifikation. Im Jahr 1972 wurde allerdings in Versuchen mit Pilzreinkulturen nachgewiesen, dass auch Pilze in der Lage sind, N2O über die Denitrifikation zu bilden. Zwei Jahrzehnte später wurde gezeigt, dass den meisten Pilzen das Enzym N2O-Reduktase fehlt. Somit ist nicht N2, sondern N2O das hauptsächliche Endprodukt der pilzlichen Denitrifikation. Dies lässt vermuten, dass die Bildung von N2O durch pilzliche Denitrifikation noch unterschätzt wird, vorausgesetzt Pilze und Bakterien haben ähnliche Prozessraten. Bisher wurde jedoch nicht ausgiebig erforscht, welchen Anteil die einzelnen mikrobiellen Gemeinschaften an der N2O Bildung tatsächlich haben.
Zur Unterscheidung der N2O Bildungsprozesse in Bezug auf die beteiligten Mikroorganismen stellt die Isotopenanalyse von N2O eine vielversprechende Anwendung dar. Vor allem die 15N-Positionspräferenz im N2O (SP = site preference, d.h. die Differenz zwischen den δ15N-Werten der außenständigen und zentralen N-Atome im linearen N2O-Molekül) aus der Denitrifikation zeigte starke Unterschiede zwischen Reinkulturen einiger Bakterien (SP = -11 bis 0 ‰) und zwei untersuchten Pilzen (SP ~ 37 ‰). Jedoch wurden Bakterienreinkulturen bisher ausgiebiger untersucht als Pilzreinkulturen, auch wenn bekannt ist, dass sich die beteiligten Enzyme bei der Denitrifikation, bis auf die NO-Reduktase, zwischen Bakterien und Pilzen nicht unterscheiden. Die verschiedenen NO-Reduktasen sind vermutlich die Ursache für die unterschiedlichen SP-Werte des von Pilzen und Bakterien produzierten N2O. Des Weiteren wurde bei Bakterien ein Austausch der Sauerstoffatome von Zwischenprodukten der Denitrifikation und dem umgebenden Wasser gefunden, der zwischen 4 und 100% beträgt. Ob es einen solchen Sauerstoffaustausch auch bei Pilzen gibt, ist bisher jedoch unerforscht. Würde der Sauerstoffaustausch bei pilzlicher Denitrifikation nicht erfolgen, ermöglichte dies neben der unterschiedlichen SP eine weitere Unterscheidung der Herkunft des N2O. Der Sauerstoffaustausch würde signifikante Unterschiede in der O Isotopensignatur im N2O pilzlicher bzw. bakterieller Herkunft verursachen.
In der vorliegenden Studie, die Aufschluss über die pilzliche N2O Produktion aus der Denitrifikation geben soll, wurden drei Hauptthemen behandelt. In einem Isotopen-Tracerexperiment mit 18O-angereichertem Wasser wurde untersucht, ob bei sechs Pilzreinkulturen ein Sauerstoffaustausch zwischen Wasser und Zwischenprodukten der Denitrifikation stattfindet. Die Pilzreinkulturen zeigten tatsächlich durch Inkorporation von 18O aus Wasser in N2O einen Sauerstoffaustausch. Auch Pilze können bis zu 100% des O während der Denitrifikation austauschen. Eine Unterscheidung zwischen der Denitrifikation durch Bakterien und Pilze anhand der Sauerstoffsignatur ist somit nicht möglich.
Das zweite Thema sollte Auskunft darüber geben, ob hohe SP-Werte des N2O aus der Denitrifikation bei Pilzreinkulturen allgemeingültig sind. Neben den zwei bisher untersuchten wurden vier weitere Pilzreinkulturen inkubiert. Diese Studie zeigte für die getesteten Pilzarten ebenfalls höhere SP-Werte (SP = 19.7 bis 32.6 ‰) im Vergleich zum Wertebereich von Bakterienreinkulturen. Basierend auf den Ergebnissen zum Sauerstoffaustausch aus dem Isotopen-Tracerexperiment wurde für die jeweiligen sechs Pilze, anhand der im Rahmen dieses Versuchs ermittelten natürlichen Sauerstoffisotopensignaturen, Mechanismen zur O Isotopenfraktionierung untersucht. Dafür wurden, neben den Werten des Sauerstoffaustausches und der natürlichen O Isotopensignatur der Pilzreinkulturen, Werte für Fraktionierungseffekte aus der Literatur in einem Isotopenfraktionierungsmodell angewendet, um die Beteiligung der verschiedenen Enzyme, die während der Denitrifikation an dem Sauerstoffaustausch beteiligt sind, abzuschätzen. Im Vergleich zu den NO3-- und NO-Reduktasen wies die N2O--Reduktase einen maßgeblich höheren Sauerstoffaustausch auf.
Die Erkenntnisse aus den Experimenten mit den Pilzereinkulturen sollten im Rahmen des dritten Themas auf Ihre Übertragbarkeit auf die mikrobiellen Gemeinschaften in Böden untersucht werden, indem Bodeninkubationsversuche mit selektiver Hemmung der Organismengruppen (Pilze und Bakterien) durchgeführt wurden. Bei dieser Modifizierung der Methode zur Substrat-induzierten Respiration mit selektiver Hemmung (SIRIN) sollte untersucht werden, ob sich die spezifischen SP-Werte für Bakterien und Pilze nach selektiver Wachstumshemmung von Bodengemeinschaften durch spezifische Antibiotika nachweisen lassen. Die Ausprägung des Hemmungseffekts auf SP-Werte in den drei getesteten Böden entsprach nicht den Erwartungswerten, die sich aus den SP-Werten der Pilz- und Bakterienreinkulturen ergaben. Die ermittelten SP-Werte lagen in den meisten Fällen im Bereich jener bakterieller Reinkulturen und eine Hemmung der Bakterien führte in keinem Fall zu der erwarteten Veränderungen der SP-Werte. Folglich konnten die SP-Werte dieser Versuche nicht dazu dienen, die N2O Bildung in den gehemmten Varianten den verschiedenen Organismengruppen zu zuordnen. Ungeklärt blieb, ob dies durch fehlende Eignung der modifizierten SIRIN-Methode zu erklären ist, oder ob die an Reinkulturen beobachteten SP-Unterschiede zwischen Pilzen und Bakterien nicht auf mikrobielle Gemeinschaften der Versuchsböden übertragbar sind. Im Hinblick auf nach wie vor bestehende methodische Defizite bei der Untersuchung der Pilzdenitrifikation im Boden sollte dies in weitergehenden Studien geklärt werden.
