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Nitrous oxide from fungal denitrification - Pure culture and soil studies using stable isotope and microbial inhibitor approaches

dc.contributor.advisorWell, Reinhard PD Dr.
dc.contributor.authorRohe, Lena
dc.date.accessioned2014-12-17T09:20:31Z
dc.date.available2014-12-17T09:20:31Z
dc.date.issued2014-12-17
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0023-9969-1
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-4829
dc.description.abstractDas Spurengas Lachgas (N<sub>2</sub>O) trägt zur Klimaerwärmung und Zerstörung der Ozonschicht in der Atmosphäre bei. Mit einem Anteil von ca. 70% sind landwirtschaftliche Böden weltweit Hauptverursacher der hohen anthropogenenN<sub>2</sub>O Emissionen. N<sub>2</sub>O entsteht in Böden durch verschiedene mikrobiologische Prozesse, bei denen N<sub>2</sub>O unter anderem aus düngerbürtigem N gebildet wird. Die Entwicklung effektiver Minderungsmaßnahmen wird erst möglich, wenn ein Verständnis der N<sub>2</sub>O Quellprozesse und ihrer Dynamik in Böden vorhanden ist. In dieser Studie wurde die Denitrifikation als ein Quellprozess untersucht, der zusammen mit Nitrifikation und Nitrifizierer-Denitrifikation hauptsächlich für die N<sub>2</sub>O Emissionen aus Böden verantwortlich ist. Die Denitrifikation beschreibt die Reduktion von Nitrat (NO<sub>3</sub><sup>-</sup>) zu N2, wobei Nitrit (NO<sub>2</sub><sup>-</sup>), Stickstoffmonoxid (NO) und N<sub>2</sub>O Zwischenprodukte dieses Reaktionsweges sind. Lange Zeit galten heterotrophe Bakterien als alleinige Verursacher von N<sub>2</sub>O Emissionen aus der Denitrifikation. Im Jahr 1972 wurde allerdings in Versuchen mit Pilzreinkulturen nachgewiesen, dass auch Pilze in der Lage sind, N<sub>2</sub>O über die Denitrifikation zu bilden. Zwei Jahrzehnte später wurde gezeigt, dass den meisten Pilzen das Enzym N<sub>2</sub>O-Reduktase fehlt. Somit ist nicht N<sub>2</sub>, sondern N<sub>2</sub>O das hauptsächliche Endprodukt der pilzlichen Denitrifikation. Dies lässt vermuten, dass die Bildung von N<sub>2</sub>O durch pilzliche Denitrifikation noch unterschätzt wird, vorausgesetzt Pilze und Bakterien haben ähnliche Prozessraten. Bisher wurde jedoch nicht ausgiebig erforscht, welchen Anteil die einzelnen mikrobiellen Gemeinschaften an der N<sub>2</sub>O Bildung tatsächlich haben. Zur Unterscheidung der N<sub>2</sub>O Bildungsprozesse in Bezug auf die beteiligten Mikroorganismen stellt die Isotopenanalyse von N<sub>2</sub>O eine vielversprechende Anwendung dar. Vor allem die <sup>15</sup>N-Positionspräferenz im N<sub>2</sub>O (SP = site preference, d.h. die Differenz zwischen den δ<sup>15</sup>N-Werten der außenständigen und zentralen N-Atome im linearen N<sub>2</sub>O-Molekül) aus der Denitrifikation zeigte starke Unterschiede zwischen Reinkulturen einiger Bakterien (SP = -11 bis 0 ‰) und zwei untersuchten Pilzen (SP ~ 37 ‰). Jedoch wurden Bakterienreinkulturen bisher ausgiebiger untersucht als Pilzreinkulturen, auch wenn bekannt ist, dass sich die beteiligten Enzyme bei der Denitrifikation, bis auf die NO-Reduktase, zwischen Bakterien und Pilzen nicht unterscheiden. Die verschiedenen NO-Reduktasen sind vermutlich die Ursache für die unterschiedlichen SP-Werte des von Pilzen und Bakterien produzierten N<sub>2</sub>O. Des Weiteren wurde bei Bakterien ein Austausch der Sauerstoffatome von Zwischenprodukten der Denitrifikation und dem umgebenden Wasser gefunden, der zwischen 4 und 100% beträgt. Ob es einen solchen Sauerstoffaustausch auch bei Pilzen gibt, ist bisher jedoch unerforscht. Würde der Sauerstoffaustausch bei pilzlicher Denitrifikation nicht erfolgen, ermöglichte dies neben der unterschiedlichen SP eine weitere Unterscheidung der Herkunft des N<sub>2</sub>O. Der Sauerstoffaustausch würde signifikante Unterschiede in der O Isotopensignatur im N<sub>2</sub>O pilzlicher bzw. bakterieller Herkunft verursachen. In der vorliegenden Studie, die Aufschluss über die pilzliche N<sub>2</sub>O Produktion aus der Denitrifikation geben soll, wurden drei Hauptthemen behandelt. In einem Isotopen-Tracerexperiment mit <up>18</sup>O-angereichertem Wasser wurde untersucht, ob bei sechs Pilzreinkulturen ein Sauerstoffaustausch zwischen Wasser und Zwischenprodukten der Denitrifikation stattfindet. Die Pilzreinkulturen zeigten tatsächlich durch Inkorporation von <sup>18</sup>O aus Wasser in N<sub>2</sub>O einen Sauerstoffaustausch. Auch Pilze können bis zu 100% des O während der Denitrifikation austauschen. Eine Unterscheidung zwischen der Denitrifikation durch Bakterien und Pilze anhand der Sauerstoffsignatur ist somit nicht möglich. Das zweite Thema sollte Auskunft darüber geben, ob hohe SP-Werte des N<sub>2</sub>O aus der Denitrifikation bei Pilzreinkulturen allgemeingültig sind. Neben den zwei bisher untersuchten wurden vier weitere Pilzreinkulturen inkubiert. Diese Studie zeigte für die getesteten Pilzarten ebenfalls höhere SP-Werte (SP = 19.7 bis 32.6 ‰) im Vergleich zum Wertebereich von Bakterienreinkulturen. Basierend auf den Ergebnissen zum Sauerstoffaustausch aus dem Isotopen-Tracerexperiment wurde für die jeweiligen sechs Pilze, anhand der im Rahmen dieses Versuchs ermittelten natürlichen Sauerstoffisotopensignaturen, Mechanismen zur O Isotopenfraktionierung untersucht. Dafür wurden, neben den Werten des Sauerstoffaustausches und der natürlichen O Isotopensignatur der Pilzreinkulturen, Werte für Fraktionierungseffekte aus der Literatur in einem Isotopenfraktionierungsmodell angewendet, um die Beteiligung der verschiedenen Enzyme, die während der Denitrifikation an dem Sauerstoffaustausch beteiligt sind, abzuschätzen. Im Vergleich zu den NO<sub>3</sub><sup>-</sup>- und NO-Reduktasen wies die N<sub>2</sub>O<sup>-</sup>-Reduktase einen maßgeblich höheren Sauerstoffaustausch auf. Die Erkenntnisse aus den Experimenten mit den Pilzereinkulturen sollten im Rahmen des dritten Themas auf Ihre Übertragbarkeit auf die mikrobiellen Gemeinschaften in Böden untersucht werden, indem Bodeninkubationsversuche mit selektiver Hemmung der Organismengruppen (Pilze und Bakterien) durchgeführt wurden. Bei dieser Modifizierung der Methode zur Substrat-induzierten Respiration mit selektiver Hemmung (SIRIN) sollte untersucht werden, ob sich die spezifischen SP-Werte für Bakterien und Pilze nach selektiver Wachstumshemmung von Bodengemeinschaften durch spezifische Antibiotika nachweisen lassen. Die Ausprägung des Hemmungseffekts auf SP-Werte in den drei getesteten Böden entsprach nicht den Erwartungswerten, die sich aus den SP-Werten der Pilz- und Bakterienreinkulturen ergaben. Die ermittelten SP-Werte lagen in den meisten Fällen im Bereich jener bakterieller Reinkulturen und eine Hemmung der Bakterien führte in keinem Fall zu der erwarteten Veränderungen der SP-Werte. Folglich konnten die SP-Werte dieser Versuche nicht dazu dienen, die N<sub>2</sub>O Bildung in den gehemmten Varianten den verschiedenen Organismengruppen zu zuordnen. Ungeklärt blieb, ob dies durch fehlende Eignung der modifizierten SIRIN-Methode zu erklären ist, oder ob die an Reinkulturen beobachteten SP-Unterschiede zwischen Pilzen und Bakterien nicht auf mikrobielle Gemeinschaften der Versuchsböden übertragbar sind. Im Hinblick auf nach wie vor bestehende methodische Defizite bei der Untersuchung der Pilzdenitrifikation im Boden sollte dies in weitergehenden Studien geklärt werden.de
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/
dc.subject.ddc630de
dc.titleNitrous oxide from fungal denitrification - Pure culture and soil studies using stable isotope and microbial inhibitor approachesde
dc.typedoctoralThesisde
dc.contributor.refereeWrage-Mönnig, Nicole Prof. Dr.
dc.date.examination2014-05-22
dc.description.abstractengThe trace gas nitrous oxide (N<sub>2</sub>O) contributes to climate change as well as to the depletion of the ozone layer in the stratosphere. Agricultural soils account for about 70% of the high anthropogenic N<sub>2</sub>O emissions. Microbial processes in soil use, for instance fertilizer N to produce N<sub>2</sub>O, are an important factor. An understanding of N<sub>2</sub>O production pathways is imperative to evaluate reliable mitigation methods for N<sub>2</sub>O emissions. The present study focused on denitrification, which, besides nitrification and nitrifier denitrification, is one of the main N<sub>2</sub>O production pathways in soils. Denitrification describes the reduction from nitrate (NO<sub>3</sub><sup>-</sup>) to N<sub>2</sub>, with nitrite (NO<sub>2</sub><sup>-</sup>), nitrous monoxide (NO) and N<sub>2</sub>O as intermediates. For a long time denitrification was attributed only to heterotrophic bacteria. In 1972, however, pure culture studies showed that fungi are also capable of denitrification, and two decades later most fungi were found to lack the N<sub>2</sub>O reductase, resulting in N<sub>2</sub>O being the main product of fungal denitrification instead of N<sub>2</sub>. This could indicate that fungi might produce more N<sub>2</sub>O compared to bacteria, providing that both groups have the same production rates. However, the contribution of different microbial groups to N<sub>2</sub>O emissions from soil has not yet been sufficiently investigated. Analysis of the isotopic signature of N<sub>2</sub>O found this to be a promising tool to distinguish between N<sub>2</sub>O produced by different microbial groups. Especially the site preference of <sup>15</sup>N in N<sub>2</sub>O (SP = difference between  δ<sup>15</sup>N of the outer and central N atoms in N<sub>2</sub>O) from denitrification revealed differences between pure bacterial cultures (SP = -11 to 0 ‰) and two studied pure fungal cultures (SP ~ 37 ‰). Although it is known that all enzymes involved in fungal denitrification, with the exception of the N<sub>2</sub>O reductase, equals the enzymes of bacteria, most denitrification studies with pure cultures covered the bacterial pathway. The different N<sub>2</sub>O reductases might be the reason for different SP of N<sub>2</sub>O produced by bacteria or fungi. An O exchange between denitrification intermediates and water between 4 and 100% was found during bacterial denitrification, while there has been no study analyzing the existence of O exchange during fungal denitrification so far. If O exchange were not to occur during fungal denitrification, this could provide an additional ability to differentiate between N<sub>2</sub>O produced by fungi or bacteria. The O isotopic signature of N<sub>2</sub>O produced by fungi would significantly differ from that produced by bacteria. The present study focused on three subjects. With an isotope tracer experiment with <sup>18</sup>O labeled water, the existence of O exchange between denitrification intermediates and water during denitrification was studied with six fungal species. The fungi showed an O exchange of up to 100% and consequently a differentiation between fungal and bacterial denitrification with an O isotopic signature is impossible. The second subject was verification of the high SP values of N<sub>2</sub>O from fungal denitrification in four additionally tested species and consideration of whether it was reproducible for the two tested species known from literature. This study confirmed higher SP values of N<sub>2</sub>O (SP = 19.7 to 31.7 ‰) compared to the SP of N<sub>2</sub>O known from bacteria. Based on the results of the isotope tracer experiment and the O isotopic signature of N<sub>2</sub>O under natural conditions, mechanisms of the O isotope fractionation were analyzed by applying values of fractionation effects known from the literature in an isotope fractionation model to estimate the involved enzymes on O exchange during denitrification. The O exchange of NO<sub>2</sub><sup>-</sup> reductase was high compared to O exchange of NO<sub>3</sub><sup>-</sup> and NO reductases. The knowledge obtained from pure fungal culture studies was used in Subject Three to test the transferability to microbial communities in soils by using microbial inhibitors for bacteria or fungi in soil incubation experiments. A modification of substrate induced respiration with selective inhibition (SIRIN) was used to determine whether the specific SP values of N<sub>2</sub>O known for bacteria and fungi are measurable after selective growth inhibition by specific antibiotic application. The expected effect of growth inhibition on SP of N<sub>2</sub>O was not found. In most cases the SP of N<sub>2</sub>O was in the range known from pure bacterial cultures and bacterial growth inhibition did not result in the expected shift of SP values. Consequently the SP values of this incubation experiment did not serve to associate the N<sub>2</sub>O production in inhibited treatments to different microbial groups. It remained unclear if this was due to the modified SIRIN method or if transferability of differences in SP of N<sub>2</sub>O known from fungi and bacteria on a microbial community in soil is possible. Future studies should approach the existing problems regarding the methods to identify fungal denitrification in soil.de
dc.contributor.coRefereeDittert, Klaus Prof. Dr.
dc.contributor.thirdRefereeFlessa, Heinz Prof. Dr.
dc.subject.eng18O isotope tracerde
dc.subject.engN2O isotopologuesde
dc.subject.engselective growth inhibitionde
dc.subject.eng15N site preferencede
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-0023-9969-1-3
dc.affiliation.instituteFakultät für Agrarwissenschaftende
dc.subject.gokfullLand- und Forstwirtschaft (PPN621302791)de
dc.identifier.ppn812930479


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