Untersuchungen zu den selbst-replizierenden Eigenschaften des pathogenen Prion-Proteins beim Menschen
Studies of the self-propagating properties of the pathogenic prion protein in humans
by Maria Cramm
Date of Examination:2016-02-08
Date of issue:2016-02-11
Advisor:Prof. Dr. Inga Zerr
Referee:Prof. Dr. Uwe Groß
Referee:Prof. Dr. André Fischer
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Format:PDF
Abstract
English
Prion diseases are transmissible, fatal neurodegenerative diseases of humans and animals. They are linked to the conversion of the cellular prion protein (PrPC) into its pathogenic form (PrPSc). Due to this conversion prion diseases are pathogenic and transmissible. Until today, neither the underlying pathogenic mechanism is understood nor has a treatment been found. To make a definite diagnosis of a sporadic prion disease a brain biopsy is required. For this reason most often a probable prion disease is diagnosed in patient’s lifetime. In combination with the clinical heterogeneity newest findings suggest the existence of human prion strains. For the search of medical compounds an adequate assay, that is based on the human pathogenesis, suitable for high-throughput screening and highly reproducible, is missing. The real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC), a recently developed in-vitro-method, allows the proof of, so far not-detectable, amounts of PrPSc in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose self-propagating properties of PrPSc get used. First examinations suggest distinct properties of human prion diseases in RT-QuIC. To get used in diagnostic and research RT-QuIC needs to get evaluated and optimized for applications with CSF. Sensitivity of RT-QuIC is 85.5 % and specificity 99.5 % for the analysis of CSF. Reproducibility shows an almost perfect agreement. Pre-analytical short-term storage of CSF at room temperature or +4°C and long-term storage at −80°C as well as repeated freezing and thawing cycles do not influence the results. However contamination with blood leads to false-negative results. These findings suggest RT-QuIC as a suitable tool for prion diagnosis in the lifetime of the patient. To characterize the influence of putative prion disease strains, CSF-samples of different human prion diseases, e. g. sporadic and genetic forms, were analyzed by RT-QuIC. The results show distinct properties of PrPSc in CSF, modulated by the type of prion disease, PRNP codon 129 genotype and disease duration. These findings show the potential of RT-QuIC to examine the self-propagating properties of PrPSc in CSF, providing for the first time a method to study these effects in patients during the symptomatic phase. To examine the potential of RT-QuIC to get used as a drug screening test, the influence of several substances on the RT-QuIC response has been investigated. Doxycycline inhibits the reaction as well in correlation to the dose as in correlation to the time of add-on. These findings suggest the suitability of RT-QuIC to search for substances, which inhibit the conversion of PrP and show the inhibiting effect of doxycycline on the in-vitro-amplification of PrPSc.
Keywords: prion protein; Creutzfeldt-Jakob disease; prion disease; fatal familial insomnia; real-time quaking-induced conversion
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Prionkrankheiten sind übertragbare, tödliche neurodegenerative Erkrankungen beim Menschen und bei Tieren. Sie basieren auf der Konversion des zellulären Prion-Proteins (PrPC) in seine pathogene Form (PrPSc). Durch diese Konversion sind Prionkrankheiten pathogen und übertragbar. Bis heute ist weder der dem zugrunde liegende Mechanismus verstanden noch eine Behandlung gefunden worden. Die sichere Diagnose einer sporadischen Prionkrankheit ist ausschließlich mittels Gehirnbiopsie möglich, weswegen zu Lebzeiten des Patienten häufig nur die Diagnose einer wahrscheinlichen Prionkrankheit erfolgt. Zusammen mit der klinischen Heterogenität der Prionkrankheiten weisen neueste Erkenntnisse auf das Vorhandensein mehrerer humaner Prionstämme hin. Für die Suche nach Medikamenten fehlt ein geeigneter Wirkstoff-Suchtest, der auf der humanen Pathogenese basiert, für einen hohen Durchsatz geeignet und gut reproduzierbar ist.
Die real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC), eine neu entwickelte in vitro-Methode, erlaubt den Nachweis von bisher nicht messbaren Mengen an PrPSc in humanem Liquor cerebrospinalis (Liquor). Dazu werden die selbst-replizierenden Eigenschaften des PrPSc genutzt. Erste Untersuchungen weisen auf distinkte Eigenschaften humaner Prionkrankheiten in der RT-QuIC hin. Zum Einsatz in Diagnostik und Forschung bedarf es jedoch einer umfassenden Validierung der Methode für die Anwendung mit humanem Liquor.
In dieser Arbeit beträgt die Sensitivität der RT-QuIC 85,5 % und die Spezifität 99,5 % für humane Prionkrankheiten. Die Reproduzierbarkeit im Ringversuch ist gut bis exzellent. Die Kurzzeitlagerungen der Liquorproben bei Raumtemperatur und +4°C sowie die Langzeitlagerung bei −80°C und das wiederholte Einfrieren und Auftauen haben keinen Einfluss auf die Testergebnisse. Jedoch führt die Kontamination mit Blut zu falsch-negativen Resultaten. Diese Ergebnisse weisen auf eine Eignung der RT-QuIC zur sicheren Diagnose von Prionkrankheiten zu Lebzeiten der Patienten hin.
Zur Charakterisierung des Reaktionspotentials möglicher humaner Prionstämme wurden Liquorproben von verschiedenen humanen Prionkrankheiten wie bspw. der sporadischen und der genetischen Form mittels RT-QuIC untersucht. Die Auswertung der Daten zeigt distinkte Eigenschaften des PrPSc im Liquor, die moduliert werden durch die Form der Prionkrankheit, den Prnp Codon 129-Genotyp und die Krankheitsdauer. Diese Ergebnisse zeigen das Potential der RT-QuIC, die selbst-replizierenden Eigenschaften des PrPSc im Liquor zu untersuchen, womit erstmals eine Methode zur Verfügung steht, um diese Effekte in Patienten während der symptomatischen Phase zu studieren.
Zur Nutzung der RT-QuIC als neuartige Methode zur Wirkstoffsuche wurde die Wirkung mehrerer Stoffe auf die RT-QuIC-Reaktion untersucht. Doxyzyklin inhibiert diese Reaktion sowohl in Korrelation mit der Dosis als auch mit dem Zeitpunkt der Zugabe. Diese Ergebnisse weisen auf eine Eignung der RT-QuIC zur Suche von Stoffen hin, die den PrP-Konversionsprozess inhibieren und zeigen die inhibierende Wirkung von Doxyzyklin auf die in-vitro-Amplifikation von PrPSc.
Schlagwörter: Prion-Protein; Creutzfeldt-Jakob Krankheit; Prionkrankheit; Tödliche Familiäre Schlafkrankheit; Real-Time Quaking-Induced Conversion