Untersuchung der submitochondrialen Verteilung von Oxa1 und Mba1 in Saccharomyces cerevisiae
Analysis of the submitochondrial distribution of Oxa1 and Mba1 in Saccharomyces cerevisiae
von Marlen Marina Stäglich
Datum der mündl. Prüfung:2015-10-15
Erschienen:2016-04-21
Betreuer:PD Dr. Wilfried Kramer
Gutachter:PD Dr. Wilfried Kramer
Gutachter:Prof. Dr. Stefan Jakobs
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Format:PDF
Zusammenfassung
Englisch
The mitochondria of eucaryotic cells are involved in several cellular processes and fulfill a multitude of fundamental tasks, such as the production of energy via the process of oxidative phosphorylation. They exhibit a high structural complexity. The outer mitochondrial membrane encloses the entire organelle and therefore delimits it against the cytoplasm. The highly infolded inner mitochondrial membrane is organized into two contiguous but morphologically distinct domains: the “cristae membrane” and the “inner boundary membrane” which faces the outer mitochondrial membrane. Previous studies provided evidence for a functional compartmentalization of the inner mitochondrial membrane because of the heterogeneous distribution of several mitochondrial proteins. In the course of these studies, the protein Oxa1 of the baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae was examined, which plays a key role not only in the insertion of nuclear encoded proteins but also of proteins encoded in the mitochondrial genome. A detailed analysis concerning the distribution of Oxa1 revealed it’s preferential localization in the inner boundary membrane when yeast cells are grown with a fermentable carbon source. However, this heterogeneous distribution changes dynamically depending on the physiological needs of the cell. Thus, in yeast cells grown with a non-fermentable carbon source, Oxa1 is enriched in the cristae membrane. A preferential localization in the cristae membrane can also be observed for Oxa1 when the evolutionary conserved amino acid tryptophan at position 128 is substituted with phenylalanine. Furthermore, the substitution mutation oxa1-W128F resulted in a decrease in the size of Oxa1 containing complexes leading to the question whether a correlation exists between the complex sizes and the submitochondrial localization of Oxa1. Therefore, the sizes of the Oxa1 containing complexes were analyzed depending on the available carbon source. In the course of this work, it has been shown that the sizes of Oxa1 containing complexes, which are located in the inner boundary membrane, do not differ from the complexes that are enriched in the cristae membrane. Accordingly, a correlation between the sizes of Oxa1 containing complexes and the submitochondrial localization of Oxa1 could not be demonstrated, and the shift in Oxa1 distribution must therefore be regulated by another mechanism. The analysis of the mutated variant Oxa1-W128F showed a reduction in the complex size in comparison to Oxa1, like it has been described previously. Further, the observed sizes of Oxa1-W128F containing complexes are in accordance to the size of an Oxa1 dimer as well as an Oxa1 tetramer, and the decrease in Oxa1 complex size can be traced back to an impairment in homooligomerization. In conjunction with the fact that no further interaction partner besides Oxa1 itself could be identified, these data suggest that Oxa1 might function as a homooligomeric complex under fermentative as well as respiratory growth conditions, and that the dynamic behaviour of Oxa1 distribution could be attributed to transient interactions with substrates. For S. cerevisiae, it has been well established that in addition to Oxa1, further mitochondrial proteins are part of the protein insertion machinery located in the inner mitochondrial membrane, including Pnt1 and Mba1. To date, no conclusive data concerning the distribution of Pnt1 and Mba1 within the inner membrane were available. In this thesis, it could be demonstrated that both Pnt1 and Mba1 are heterogeneously distributed with an enrichment in the inner boundary membrane under fermentative growth conditions. In the case of Pnt1, the subjection of the yeast cells to respiratory growth conditions resulted in a change of the preferential localization from the inner boundary membrane to the cristae membrane, like it has been reported for Oxa1. In contrast to Oxa1 and Pnt1, the protein Mba1 remained enriched in the inner boundary membrane. Therefore, the present study could show that the heterogeneous distribution of Pnt1 displays a dynamic which is dependent on the physiological conditions, whereas the heterogeneous distribution of Mba1 is static. Based on the diverse localization behaviour of Mba1 in comparison to Oxa1 and Pnt1, a more detailed investigation of the submitochondrial localization of Mba1 was performed. The analysis of the causes leading to the static heterogeneous distribution of Mba1 on a molecular level, revealed that already the deletion of five amino acids (mba1 1-273) as well as the substitution of a single amino acid (mba1-I272A) of the C-terminal part of Mba1 results in a drastic alteration of Mba1 distribution. The study of the consequences of the gene mutations on Mba1 function showed that the deletion mutation causes a decreased respiration competency of the yeast cells which can be attributed to an impairment in the assembly of a super complex of the respiratory chain (2 x complexIII / 2 x complexIV). Therefore, this thesis provides evidence that the static heterogeneous distribution of Mba1 within the inner mitochondrial membrane is crucial for Mba1 function. It is possible that the binding of a currently unknown interaction partner determines the location of Mba1 function.
Keywords: mitochondria; Oxa1; Mba1; submitochondrial localization; compartmentalization of the mitochondrial inner membrane; Saccharomyces cerevisiae; baker's yeast
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Die Mitochondrien eukaryotischer Zellen sind an einer Reihe zellulärer Prozesse beteiligt und übernehmen essentielle Funktionen, wie die der Energiegewinnung aus der oxidativen Phosphorylierung. Sie weisen ein hohes Maß an struktureller Komplexität auf. Das gesamte Organell wird von der äußeren mitochondrialen Membran umgeben und ist durch diese gegenüber dem Zytoplasma abgegrenzt. Die innere mitochondriale Membran kann morphologisch in zwei Bereiche unterteilt werden: Der der äußeren Membran direkt gegenüberliegende Teil wird als „innere Grenzflächenmembran“ bezeichnet, während zahlreiche Einstülpungen die sogenannte „Cristaemembran“ bilden.
Vorhergehende Studien lieferten Hinweise darauf, dass es sich bei der Subkompartimentierung der Innenmembran auch um eine funktionale Gliederung handeln könnte, da für zahlreiche mitochondriale Proteine eine heterogene Verteilung nachgewiesen werden konnte. Darunter befindet sich auch das Protein Oxa1 der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, das sowohl bei der Insertion von kernkodierten als auch von mitochondrial kodierten Proteinen eine zentrale Rolle spielt. In vorausgegangenen Arbeiten wurde belegt, dass Oxa1 bevorzugt in der inneren Grenzflächenmembran vorliegt, wenn die Hefen mit einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle wachsen. Diese Verteilung ist jedoch dynamisch und verändert sich in Abhängigkeit von den physiologischen Bedürfnissen der Zellen. Wachsen die Hefen mit einer nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquelle, weist Oxa1 eine präferentielle Lokalisation in der Cristaemembran auf. Eine Anreicherung in der Cristaemembran ist auch zu beobachten, wenn die hoch konservierte Aminosäure Tryptophan an Position 128 mit Phenylalanin substituiert wird. Die Substitutionsmutation oxa1-W128F führt darüber hinaus zu einer Verringerung der durchschnittlichen Größen der Oxa1-enthaltenden Komplexe. Hieraus ergab sich die Frage, ob die Komplexgröße und die submitochondriale Lokalisation von Oxa1 in direktem Zusammenhang stehen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Größen der Oxa1-enthaltenden Komplexe in Abhängigkeit zu der zur Verfügung stehenden Kohlenstoffquelle untersucht. Es zeigte sich jedoch, dass die durchschnittlichen Größen der Oxa1-enthaltenden Komplexe, die in der inneren Grenzflächenmembran angereichert sind, ungefähr den Größen der Komplexe entsprechen, die bevorzugt in der Cristaemembran vorliegen. Demzufolge gibt es keinen Zusammenhang zwischen der Komplexgröße und der Lokalisation von Oxa1, weshalb der Veränderung der Lokalisation ein anderer Mechanismus zu Grunde liegen muss. Die Untersuchung der Variante Oxa1-W128F zeigte, dass diese im Vergleich zu Oxa1, wie bereits beschrieben, in kleineren Komplexen vorliegt, bei denen es sich sogar um Dimere sowie Tetramere von Oxa1 handeln könnte, und, dass die Verringerung der Komplexgrößen auf eine beeinträchtigte Homooligomerisierung zurückgeführt werden kann. Zusammen mit der Tatsache, dass neben Oxa1 selbst keine weiteren Interaktionspartner identifiziert werden konnten, legen diese Ergebnisse nahe, dass Oxa1 sowohl unter fermentativen als auch respiratorischen Bedingungen in größeren homooligomeren Komplexen agieren könnte und, dass seine Dynamik möglicherweise auf transiente Interaktionen mit Substraten zurückzuführen ist.
Es ist bekannt, dass in S. cerevisiae neben Oxa1 noch weitere Proteine existieren, die ebenfalls Teil der Proteininsertionsmaschinerie der inneren mitochondrialen Membran sind. Dazu gehören Pnt1 und Mba1, über deren Verteilung in der inneren Membran bisher keine gesicherten Erkenntnisse vorlagen. Im Rahmen dieser Arbeit stellte sich heraus, dass auch Pnt1 und Mba1 heterogen verteilt sind. So ist sowohl für Pnt1 als auch für Mba1 bei Wachstum mit einer fermentierbaren Kohlenstoffquelle eine Anreicherung in der inneren Grenzflächenmembran zu verzeichnen. Bei Wachstum mit einer nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquelle verschiebt sich die präferentielle Lokalisation von Pnt1 zu einer Anreicherung in der Cristaemembran, wie es bereits für Oxa1 beobachtet wurde. Mba1 hingegen liegt unverändert bevorzugt in der inneren Grenzflächenmembran vor. Somit konnte für die heterogene Verteilung von Pnt1 eine von den physiologischen Bedingungen abhängige Dynamik und für die heterogene Verteilung von Mba1 eine Statik nachgewiesen werden.
Auf Grund des differenzierten Lokalisationsverhaltens von Mba1 im Vergleich zu Oxa1 und Pnt1, wurde eine nähere Charakterisierung der submitochondrialen Verteilung von Mba1 vorgenommen. Bei der Untersuchung der Ursachen der statischen Lokalisation von Mba1 auf molekularer Ebene, wurde festgestellt, dass bereits die Deletion von nur fünf Aminosäuren (mba1 1-273) sowie die Substitution einer einzelnen Aminosäure (mba1-I272A) im C-Terminus von Mba1 zu einer drastischen Veränderung der heterogenen Mba1-Verteilung führt. Die Untersuchung der Auswirkungen der Genmutationen auf die Funktion von Mba1 zeigte, dass es infolge der Deletionsmutation zu einer verminderten Respirationskompetenz der Zellen kommt, die auf eine Beeinträchtigung der Assemblierung eines Superkomplexes der Atmungskette (2 x KomplexIII / 2 x KomplexIV) zurückgeführt werden kann. Somit liefert die vorliegende Arbeit erstmals Hinweise darauf, dass die dokumentierte heterogene und statische Verteilung von Mba1 in der inneren Membran ausschlaggebend für die korrekte Funktionsweise von Mba1 ist. Möglicherweise wird der Funktionsort von Mba1 durch die Bindung eines bisher nicht eindeutig identifizierten Interaktionspartners bestimmt.
Schlagwörter: Mitochondrien; Oxa1; Mba1; submitochondriale Verteilung; Subkompartimentierung der inneren mitochondrialen Membran; Saccharomyces cerevisiae; Bäckerhefe