| dc.contributor.advisor | Eichele, Gregor Prof. Dr. | |
| dc.contributor.author | Ilangovan, Vinodh | |
| dc.date.accessioned | 2016-10-14T13:05:48Z | |
| dc.date.available | 2016-10-14T13:05:48Z | |
| dc.date.issued | 2016-10-14 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-002B-7C26-F | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-5900 | |
| dc.description.abstract | Die Acetyltransferase TIP60/KAT5 steuert die circadiane Uhr in Drosophila
Endogene Uhren steuern verhaltensbezogene und physiologische Prozesse in einer rhythmischen Weise, die eine Periodizität von ~24 h aufweist. Drosophila zeigt einen robusten Rhythmus von Aktivitäts- /Ruhephasen, der von im Gehirn befindlichen zirkadianen Schrittmacherneuronen gesteuert wird. Angeborene Rhythmen der Genexpression werden durch positive und negative transkriptionelle/translationale Rückkopplungsschleifen, die die circadiane Uhr antreiben, generiert. Obwohl die Regulierung der Rückkopplung von Uhrengenen relativ gut verstanden ist, sind die Faktoren, die die Aktivatoren stimulieren, einen neuen circadianen Zyklus zu beginnen, noch unbekannt. Posttranslationale Modifikationen spezifischer Proteine durch Acetylierung erleichtert die Gentranskription. TIP60/KAT5 ist ein Mitglied der hochkonservierten MYST-Familie von Acetyltransferasen und ist an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt, wie beispielsweise Zellwachstum und DNA-Reparatur, undzwar indem es verschiedene Zielproteine acetyliert. Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, die Mechanismen, durch die Lysin-Acetyltransferase TIP60/KAT5 die circadiane Uhr von Drosophila steuert, zu untersuchen.
Das binäre UAS/GAL4 System wurde eingesetzt, um einen gezielten knock down (durch RNA-Interferenz) oder eine Überexpression (eine Mutation in der für die Katalyse essentiellen Aminosäure, wodurch eine dominant negative Funktion verursacht wird) von TIP60/KAT5 in zirkadianen Schrittmacherneuronen zu erreichen. Das temperatursensitive GAL80 (TARGET) System wurde verwendet, um die normale Entwicklung der Schrittmacherneuronen bis ins Erwachsenenstadium zu ermöglichen. Unter Verwendung von nicht-invasiven lokomotorischen Aktivitätstests konnte gezeigt werden, dass TIP60 in Schrittmacherneuronen für den robusten zirkadianen Rhythmus in Abwesenheit von Zeitgebern im adulten Stadium erforderlich ist. In Übereinstimmung mit den beobachteten Veränderungen des circadianen Bewegungsverhaltens, war die rhythmische Expression von wichtigen clock-controlled genes wie Period und Timeless sowie Genen der Hilfsschleife Vrille und Clockwork orange gedämpft. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass die Tip60 mRNA unabhängig von der Uhr reguliert wird. Das zirkadiane Bewegungsverhalten wurde genutzt, um zu beurteilen, ob Untereinheiten des TIP60 (Nu4A) multimeren Komplexes auch an der Regulation des Rhythmus beteiligt sind. Um die Zielproteine von TIP60 in der circadianen Uhr zu bestimmen, wurde ein genetischer Interaktions-Test unter Verwendung des Phänotyps der circadianen Lokomotoraktivität durchgeführt und es wurde eine starke Interaktion mit dem zirkadianen Co-Aktivator CYCLE und dem Repressor PERIOD in trans-heterozygoten Kreuzungen gefunden.
Aufgrund des Fehlens eines spezifischen Antikörpers, um die Funktion von TIP60 in vivo in adulter Drosophila zu untersuchen, wurde ein transgener Stamm (UAS dTIP60-HA) mit einem Hämagglutinin-Epitop-Tag erzeugt. Dieser transgene Stamm wurde genutzt, um TIP60-HA unter Verwendung eines ubiquitären Promotors (tub GAL4) überzuexprimieren. Ein Antikörper gegen das Epitop (Anti-HA) wurde verwendet, um einen Chromatin-Immunopräzipitations-Assay (ChIP) in diesen transgenen Fliegen durchzuführen. Es zeigte sich, dass TIP60 rhythmisch in der regulatorischen Region von clock-controlledgenes lokalisiert ist, was eine rhythmische Belegung von DNA-Elementen, ähnlich dem CLOCK/CYCLE Komplex, nahelegt. Co-Immunpräzipitation wurde mit transgenen Fliegen durchgeführt, um eine Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen TIP60 und CYCLE nachzuweisen. Die Ergebnisse dieser Studie legen deutlich eine Beteiligung von TIP60/KAT5 als Co-Aktivator an der präzisen Steuerung der circadianen Uhr in Drosophila nahe.
Deutsche Übersetzung: Dr. Inga Urban | de |
| dc.language.iso | eng | de |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ | |
| dc.subject.ddc | 570 | de |
| dc.title | Acetyltransferase TIP60/KAT5 regulates the Drosophila Circadian Clock | de |
| dc.type | doctoralThesis | de |
| dc.contributor.referee | Fiala, André Prof. Dr. | |
| dc.date.examination | 2015-10-13 | |
| dc.description.abstracteng | Endogenous clocks control behavioral and physiological processes in a rhythmic fashion exhibiting periodicity of ~24 h. Drosophila exhibits a robust rhythm in activity/rest patterns which is controlled by circadian pacemaker neurons situated in the brain. Innate rhythms of gene expression are generated by the translational transcriptional positive and negative feedback driving the circadian clock. Although the feedback regulation of clock genes is relatively well understood, the factors that stimulate activators to start a new circadian cycle remain unclear. Post-translational modification of specific proteins by acetylation facilitates gene transcription. TIP60/KAT5 is a member of the well conserved MYST family of acetyltransferases and is involved in a variety of cellular processes such as cell growth and DNA repair by acetylating several target proteins. The main goal of this work is to investigate the mechanisms by which lysine acetyltransferase TIP60/KAT5 orchestrates the circadian clock of Drosophila.
UAS/GAL4 binary system was utilized to achieve targeted knock down (by RNA interference) or overexpression (a mutation in the catalytic residue rendering dominant negative function) of TIP60/KAT5 in circadian pacemaker neurons. The temperature sensitive GAL80 (TARGET) system was used to allow proper development of pacemaker neurons until adulthood. Non-invasive locomotor activity assays demonstrated that TIP60 in pacemaker neurons is required for robust circadian rhythm in the absence of time cues during adulthood. Consistent with the observed changes in circadian locomotor behavior, rhythmic expression of key clock controlled genes such as Period and Timeless as well as auxiliary loop genes Vrille and Clockwork orange was dampened. However, Tip60 mRNA was found to be regulated independently of the clock. Circadian locomotor behavior was employed to assess if individual subunits of Nu4A multimeric complex also participate in regulation of rhythm. In order to determine the targets of TIP60 in the circadian clock, a genetic interaction assay using adult circadian locomotor activity phenotype was performed and a strong interaction with the circadian co-activator CYCLE and the repressor PERIOD was found in trans-heterozygous crosses.
Due to non-availability of a specific antibody to study the function of TIP60 in vivo in adult Drosophila, a transgenic strain (UAS dTIP60-HA) with hemagglutinin epitope tag was generated. This transgenic strain was used to overexpress TIP60-HA using a ubiquitous promoter (tub GAL4). Using an antibody against the epitope (anti-HA) chromatin immuno-precipitation (ChIP) was performed in these transgenic flies. TIP60 was found to be localized rhythmically in the regulatory region of clock controlled genes, indicating a rhythmic occupancy at DNA elements similar to CLOCK/CYCLE complex. Co-immunoprecipitation was performed with transgenic flies to demonstrate protein-protein interaction of TIP60 and CYCLE. These results further validate the genetic interaction between TIP60 and CYCLE. The findings of this study clearly indicate a role of TIP60/KAT5 as a co-activator in the precise regulation of Drosophila circadian clock. | de |
| dc.contributor.coReferee | Halyna, Shcherbata Dr. | |
| dc.subject.eng | Circadian Clock, Drosophila, TIP60, acetyltransferase, gene expression, rhythms, genetics, behavior | de |
| dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-002B-7C26-F-2 | |
| dc.affiliation.institute | Göttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften, Biophysik und molekulare Biowissenschaften (GGNB) | de |
| dc.subject.gokfull | Biologie (PPN619462639) | de |
| dc.identifier.ppn | 870226355 | |