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Charakterisierung induzierter, kolorektaler Lebermetastasen in einem Mausmodell und Einfluss von Makrophagenphänotypen auf die Tumorprogression

dc.contributor.advisorKönig, Sarah Prof. Dr.
dc.contributor.authorBocuk, Derya
dc.date.accessioned2017-01-12T09:40:01Z
dc.date.available2017-01-12T09:40:01Z
dc.date.issued2017-01-12
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-002B-7CFF-9
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-6075
dc.description.abstractDie Leber nimmt als Hauptzielorgan des metastasierenden Kolorektalkarzinoms (CRC) eine exponierte Rolle ein; bei mehr als 50 % der betroffenen Patienten werden im Laufe ihrer Tumorerkrankung Lebermetastasen diagnostiziert, die trotz multimodaler Therapiekonzepte immer noch den fatalen Kranksheitsverlauf bestimmen. Zwecks Entwicklung neuer Therapiestrategien ist ein fundiertes Verständnis der Entstehungsmechanismen und des Genexpressionsprofils der Metastasen erforderlich. Makrophagen wird in diesem Kontext ein großer Einfluss auf die Tumorentstehung und -progression zugeschrieben, weshalb von einer klinischen Relevanz der Makrophagenpolarisation auszugehen ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mit der CRC Zelllinie CMT-93 ein syngenes, orthotopes Lebermetastasenmodell in C57BL/6N Mäusen etabliert. Basierend auf RNA Sequenzierungsdaten und bioinformatischen Analysemethoden wurde eine Entwicklung und fein abgestimmte Adaptation der CMT-93 Zellen im Zuge ihrer Propagation im hepatischen Milieu nachgewiesen. Diese resultierte in divergierenden Genexpressionsprofilen zwischen Zelllinie und Metastasen. Von insgesamt 3329 differentiell exprimierten Genen wurden mittels einer Selektionsliste 32 signifikant exprimierte Gene identifiziert. Insbesondere Matrix-Metalloproteasen (MMP-2, -7, -9), Chemokinrezeptoren (CXCR2, CXCR4), Zelladhäsionsgene (ITGA6, ITGB3) sowie Wif1 als Feinregulator des kanonischen Wnt Signalweges nehmen eine bedeutende Rolle ein und tragen zum Invasions- und Metastasierungsprofil von CMT-93 Zellen unter dem Einfluss des Lebermilieus bei. Invasive und aggressive Eigenschaften der CMT-93 induzierten Lebermetastasen wurden insbesondere im frühen und späten Metastasierungsstadium nachgewiesen. Hier wurde u.a. die Expression der EMT Marker Vimentin, MMP-7 und CD44, Ki-67, NFkb1 und Stat3 untersucht. Eine Gene Ontology Analyse und RNA Sequenzierungsdaten verschiedener Leberareale zeigten, dass die vielschichtige Interaktion zwischen CMT-93 Zellen und der hepatischen Mikroumgebung u.a. durch immunregulatorische Prozesse gesteuert wird, die in veränderten Genexpressionsprofilen zwischen Zelllinie, Metastase und tumorumgebendem Gewebe resultiert. In Lebermetastasen konnte eine Mischpopulation aus M1 und M2 Makrophagen nachgewiesen werden, die einen tendenziell M2 geprägten Charakter aufweisen. Dieser ist höchstwahrscheinlich an einer Stimulation der invasiven Eigenschaften der Tumorzellen beteiligt. Durch qRT-PCR und immunhistochemische Analysen konnten Hinweise gesammelt werden, dass nicht explizit die Quantität oder spezifische Lokalisation von Makrophagenphänotypen, sondern mutmaßlich eher das Zytokinprofil des Tumors und der Mikroumgebung und damit einhergehend der Polarisationsstatus der Makrophagen zum Metastasierungserfolg beiträgt. Eine Inkubation von CMT-93 Zellen mit konditionierten Medien der verschiedenen Makrophagenphänotypen bestätigte die Rolle sezernierter Faktoren. Eine indirekte Interaktion zwischen Tumorzelle und M2 Makrophagen reicht offensichtlich aus, um tumorstimulierende Eigenschaften, Aggressivität und Proliferationsfähigkeit der Zelllinie zu beeinflussen. Somit wurden Gene und Signalwege identifiziert, die relevant sind für eine erfolgreiche Induktion und Progression von Lebermetastasen infolge der Implantation von CRC-Zellen. Eine Adaptation des Genexpressionsprofils der CMT-93 Zelllinie im Zuge der Leberkolonisation konnte nachgewiesen werden. Das molekulare Profil bzw. die Gensignatur der Metastasen korrelierte dabei in hohem Maße mit der Migrations- und Invasionsfähigkeit der Tumorzellen. Insbesondere die Anwendung bioinformatischer Methoden erwies sich dabei als nützliches Werkzeug zur Analyse von großen Datensätzen, die mittels RNA Sequenzierung generiert wurden. Diese werden nun zur Formulierung prädiktiver Modelle der Metastasierungsvorgänge genutzt, um deregulierte Gene und damit einhergehend die Aggressivität von Tumorzellen gezielt identifizieren und konsekutiv beeinflussen zu können. Eine Analyse der Makrophagenphänotypen und ihrer Interaktion mit Tumorzellen verdeutlichte den durchaus tumorstimulierend geprägten Charakter der CMT-93 induzierten Lebermetastasen und den Einfluss des Zytokinprofils auf die Tumorprogression. Eine weiterführende Untersuchung der Makrophagenpolarisation bedarf jedoch eine rigorose Charakterisierung der Phänotypen anhand weiterer spezifischer Marker. Die subtile Analyse wird Rückschlüsse der organspezifischen Einflüsse des Zytokinprofils auf die kolorektale Karzinogenese erlauben.de
dc.language.isodeude
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject.ddc610
dc.titleCharakterisierung induzierter, kolorektaler Lebermetastasen in einem Mausmodell und Einfluss von Makrophagenphänotypen auf die Tumorprogressionde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedCharacterization of colorectal cancer induced liver metastases and the impact of macrophage phenotypes on tumor progressionde
dc.contributor.refereeKönig, Sarah Prof. Dr.
dc.date.examination2016-12-21
dc.description.abstractengThe liver is considered to be the primary target organ for hematogenous spread of colorectal cancer (CRC), as more than 50 % of affected patients develop liver metastases during the course of their tumor disease. Due to the fact, that liver metastases do not respond sufficiently to current systemic therapies, there is a strong need for profound knowledge concerning the underlying mechanisms of metastases formation and their molecular profile aiming to generate new targeted therapy strategies. Based on their bimodal role and high level of plasticity macrophages are being considered to have a substantial impact on tumor progression. Thus, the polarization of macrophages is having a clinical relevance which has to be addressed in order to comprehend the tumor immunobiology and the underlying processes of generating macrophage phenotypes. Within the scope of the present study a syngeneic and orthotopic liver metastasis model was established by inoculation of the colorectal cancer cell line CMT-93 via the portal vein in C57BL/6N mice livers. RNA Sequencing data and bioinformatical analysis demonstrated a clear evolution and well-orchestrated adaptation of the cell line on propagation in the liver environment resulting in diverging gene expression profiles of CMT-93 cells and corresponding metastases. 32 out of 3329 in total differentially expressed genes were identified by using a selection list to be significantly relevant for metastases formation. In particular, matrix metalloproteinases (MMP-2, -7, -9), chemokine receptors (CXCR2, CXCR4), cell adhesion genes (ITGA6, ITGB3) as well as Wif1 as a component of the canonical Wnt signaling pathway enhance the invasiveness and metastatic potential of CMT-93 cells. An invasive and aggressive growth pattern of CMT-93 induced liver metastases was revealed, especially in the early and late stage of metastases formation, by upregulation of genes/proteins such as Vimentin, MMP-7 and CD44 as EMT markers as well as Ki-67, NFkB1 and Stat3. Gene Ontology analysis and RNA Sequencing data of different liver areas determined immunoregulatory processes, among others, being responsible for a brisk and many-faceted interaction between CMT-93 cells and their hepatic microenvironment resulting in diverging gene expression profiles of the cell line, metastases and tumor-surrounding tissue. Analyses also revealed a mixed population of M1 and M2 macrophage phenotypes localized in liver metastases with a tendentially M2-shaped character. RNA Sequencing, qRT-PCR and immunohistochemical analysis displayed the cytokine profile of tumors and their microenvironment concomitant with the polarization status of macrophages having a huge impact on metastases formation rather than an accurate number or specific localization of macrophage phenotypes. Coculture experiments of CMT-93 cells with conditioned media of macrophage phenotypes verified the role of secreted factors. An indirect, non-physical interaction between tumor cells and M2 macrophages is obviously sufficient to promote tumor stimulating properties, aggressiveness and proliferation abilities of tumor cells. Taken all together genes and pathways have been identified, which can be considered to be involved in CRC induced liver metastases. CMT-93 cells displayed a well-orchestrated adaptation of their gene expression profile during the colonization of a foreign organ. A strong correlation of the gene signature of liver metastases with migration and invasiveness of tumor cells has been demonstrated. In particular, the implementation of bioinformatical methods turned out to be a great tool to analyze large amounts of data derived from RNA sequencing. Those data sets are now being used to establish predictive models for metastases formation. Thus, a targeted modification or inhibition of dysregulated genes followed by a diminished aggressiveness of tumor cells will be enabled. An analysis of macrophage phenotypes and their interaction with tumor cells elucidated a rather tumor promoting character of CMT-93 induced liver metastases and the impact of the cytokine profile on tumor progression. Nevertheless, a rigorous characterization of macrophage phenotypes and their polarization status needs to be addressed in further studies by using additional specific markers. Hereby, we will be able to deepen our knowledge regarding the organ specific influence of cytokine profiles in the context of colorectal cancer.de
dc.contributor.coRefereeAlves, Frauke Prof. Dr.
dc.subject.gerKolorektalkarzinomde
dc.subject.gerRNA Sequenzierungde
dc.subject.gerGenexpressionde
dc.subject.gerLebermetastasende
dc.subject.gerMakrophagende
dc.subject.gerMakrophagenphänotypende
dc.subject.engColorectal Cancer (CRC)de
dc.subject.engRNA Sequencingde
dc.subject.engGene Expressionde
dc.subject.engLiver Metastasisde
dc.subject.engMacrophagesde
dc.subject.engMacrophage phenotypesde
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-002B-7CFF-9-4
dc.affiliation.instituteMedizinische Fakultät
dc.subject.gokfullMedizin (PPN619874732)de
dc.subject.gokfullBiologie (PPN619875151)de
dc.identifier.ppn876628498


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