Molekulare Mechanismen der antiproliferativen und antifibrotischen Wirkung von Mycophenolsäure in vitro

Molecular mechanisms of the antiproliferative and antifibrotic action of mycophenolic acid in vitro

by Christian Koch
Doctoral thesis
Date of Examination:2018-01-17
Date of issue:2018-01-02
Advisor:Dr. Darinka T. Petrova
Referee:Prof. Dr. Michael Oellerich
Referee:Prof. Dr. Michael Zeisberg
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-6624

 

 

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Abstract

English

The aim of this study was to elucidate functional and molecular effects of mycophenolic acid (MPA) on non-lymphatic, kidney epithelial cells treated with transforming growth factor (TGF). MPA effects were studied using HK2 cells incubated with EGF and TGF. The reversibility of these effects was verified using guanosine and 8-aminoguanosine. The following assays were applied: cell proliferation, viability, collagen matrix contraction, scratch wound closure, spindle index, FACS with anti-CD29 and anti-CD326, promoter demethylation of RAS protein activator like 1 (RASAL1), as well as gene expression of RASAL1, integrin 1ß (ITGB1) (CD29) and epithelial cell adhesion molecule (EpCam) (CD326). Cell proliferation was inhibited by increasing concentrations of MPA, whereas neither apoptosis nor cytotoxicity was detected. Stimulation with EGF and/or TGF led to a significant collagen matrix contraction that was successfully inhibited by MPA. In addition, scratch wound closure was inhibited by incubation with TGF alone or with EGF. Under the same conditions, cell morphology (spindle shape) and molecular phenotype (ITGB1(High)EpCam(Low)/ITGB1(Low)EpCam(High)) were both significantly changed, suggesting an epithelial to mesenchymal transformation. Cell morphology and motility, as well as molecular phenotype, were reversible after MPA treatment with TGF transformation in both presence/absence of EGF, thereby suggesting a correlation with the previously described antifibrotic effects of MPA. Dysregulation of TGF signal transduction appears to be related to progression of fibrosis. A TGF-transformed kidney epithelial cell line derived from human proximal tubules was used to study whether the immunosuppressive drug: MPA possesses any functional or molecular antifibrotic effects. Functional and morphological in vitro changes induced by both the TGF and epithelial-growth-factor were reversible by treatment with MPA.
Keywords: epithelial to mesenchymal transition; growth factors; kidney fibrosis; mycophenolic acid; transformation

German

Die spezifische immunsuppressive und antiproliferative Wirkung der Mycophenolsäure führt zur Hemmung der De-novo-Purinsynthese in Lymphozyten. Darüber hinaus, scheint sie auch auf nicht lymphatische Zellen wie Fibroblasten und Epithelzellen Einfluss zu nehmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der potentiell inhibitorische Einfluss der Mycophenolsäure auf die im Rahmen des Pathomechanismus der Nierenfibrose mehrfach postulierte epitheliale mesenchymale Transition (EMT Typ II) von Tubulusepithelzellen weiter untersucht. Um den funktionellen Einfluss von MPA auf Epithelzellen studieren zu können, wurde eine EGF-abhängige humane Epithelzelllinie aus proximalen Nierentubuli (HK-2) mit den Wachstumsfaktoren EGF und/oder TGFß1 stimuliert. Simultan erfolgte die Überprüfung der Reversibilität der Wirkung von MPA durch Antagonisierung mit Guanosin/8Aminoguanosin. Der Einfluss von MPA und dessen Reversibilität wurden im Rahmen diverser Invitro-Experimente überprüft: Zellproliferation und -vitalität, Kollagen-MatrixKontraktion, Wundverschluss, Spindle-Index, Genexpression epithel- und fibroseassoziierter Gene (s. u.), durchflusszytometrische Quantifizierung antiCD29- und anti-CD326-markierter Zellen, Untersuchung des Proteoms und Phosphoproteoms. Die Zellproliferation wurde in Abhängigkeit von o. g. Modulatoren unter steigenden MPA-Konzentrationen gehemmt. Die Stimulation mit EGF und/oder TGFß1 führte zu einer signifikanten Kollagen-Matrix-Kontraktion, welche durch die Zugabe von MPA suffizient inhibiert werden konnte. Dies suggeriert, dass die Mycophenolsäure in der Lage zu sein scheint, die Fähigkeit von Epithelzellen, Kollagengitter zu bilden, auf hemmende Weise zu beeinflussen vermag. Weiterhin konnte auch der durch TGFß1 und EGF initiierte Wundverschluss durch Zugabe von MPA entschleunigt werden. Unter der Behandlung mit der Kombination beider Wachstumsfaktoren resultierten signifikant spindelförmigere HK-2-Zellen. Diese Beobachtung würde eine stattgehabte EMT Typ II, zumindest aus rein deskriptiver Sicht, unterstützen. Durch die Zugabe von MPA konnte auch dieser Effekt gehemmt werden. Zwei unterschiedlich regulierte Gene, ITGB1 und EpCAM, wurden auf Proteinebene unter Anwendung durchflusszytometrischer Analyse ergänzend untersucht. MPA scheint hierbei jedoch einen eigenständigen Effekt auf die Synthese von CD326 zu haben. In der Erfassung der unter der verwendeten Stimulation veränderten Proteine einschließlich ihres Phophorylierungsstatus wurden 12 in einem Netzwerk befindliche und interagierende Proteine unter dem Einfluss von EGF sowie 22 kommunizierende Proteine unter dem Einfluss von MPA gefunden. Die durch die Wirkung der verwendeten Wachstumsfaktoren bedingten Veränderungen sowohl der Zellmorphologie und -motilität als auch des molekularen Phänotyps waren unter der Behandlung mit MPA reversibel, was mit dem beschriebenen antifibrotischen Potential der Mycophenolsäure vereinbar ist.
 
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