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Molekulare Determinanten zur sequenzspezifischen DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors STAT1

dc.contributor.advisorMeyer, Thomas Prof. Dr.
dc.contributor.authorHüntelmann, Bettina
dc.date.accessioned2018-01-09T09:59:05Z
dc.date.available2018-01-16T23:50:42Z
dc.date.issued2018-01-09
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-002E-E319-6
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-6655
dc.language.isodeude
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject.ddc610de
dc.titleMolekulare Determinanten zur sequenzspezifischen DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors STAT1de
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedMolecular determinants for sequence-specific DNA binding of the transcription factor STAT1de
dc.contributor.refereeMeyer, Thomas Prof. Dr.
dc.date.examination2018-01-09
dc.description.abstractgerSTAT-Proteine (Signaltransduktor und Aktivator der Transkription) haben eine essentielle Rolle in einem der ältesten und hochkonservierten Signaltransduktionswege, dem JAK-STAT-Signaltransduktionsweg. Sie leiten die an der Plasmamembran ankommenden Signale vieler Zytokine bis in den Zellkern weiter und bewirken dort eine Modulation der Genexpression. Dadurch sind sie an der Vermittlung von Prozessen wie dem Zellwachstum und der Immunantwort beteiligt. Ein Kennzeichen der Geninduktion der STAT-Proteine ist die Bindung an spezifische Palindrom-Sequenzen, bezeichnet als Gamma-aktivierte Stellen (GAS). Da jedoch der genaue Mechanismus der signalabhängigen Zielgenerkennung durch Tyrosin-phosphorylierte STAT-Dimere nicht sehr umfassend untersucht ist, wurden in dieser Arbeit durch gerichtete Mutagenesen nach Alanin Aminosäureaustausche in der STAT1-Linker- sowie der -DNA-Bindedomäne generiert und diese funktionell charakterisiert. Die drei Aminosäurereste der STAT1-Linker-Domäne (E559, E563 und K567) befinden sich auf einem unter den sieben humanen STAT-Proteinen hochkonservierten Sequenzmuster, auf dem oberflächliche Reste in unmittelbarer Nähe zur gebundenen DNA lokalisiert sind. Die Substitutionsmutation des konservierten Lysinrests in Position 567 führte zum Verlust der spezifischen Bindung an hochaffinen GAS-Stellen, wie auch zum Verlust der Transaktivierung von endogenen Zielgenen in IFNγ-stimulierten Zellen, während sich der zeitliche Verlauf transienter Kernakkumulation und Tyrosin-Phosphorylierung nicht vom Wildtyp-Molekül unterschieden. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass der Lysinrest in Position 567 der STAT1-Linker-Domäne für die sequenzspezifische GAS-Erkennung erforderlich ist. Demgegenüber konnte nachgewiesen werden, dass zwei Glutaminsäurereste an den Positionen E559 und E563 auf jedem Protomer für die Dissoziation der STAT1-Dimere von der DNA wichtig sind. Die Mutagenese der Glutaminsäurereste führt zu einer erhöhten Rate an Tyrosin-phosphoryliertem STAT1 sowie zu einer verlängerten IFNγ-stimulierten Anreicherung im Zellkern. Die Charakterisierung der nach Alanin substituierten Punktmutante K350A der STAT1 DNA-Bindedomäne dagegen erbrachte bei einem im Vergleich zum Wildtyp ähnlichen Phänotyp keine weiteren Aufschlüsse über molekulare Mechanismen der signalabhängigen Zielgenerkennung bzw. DNA-Bindung. Zusammenfassend bestätigen die Daten einen Einfluss der Linker-Domäne auf die Kinetik der signalabhängigen GAS-Bindung durch die Anordnung der an der Innenfläche des STAT1-Dimers lokalisierten Glutaminsäurereste E559 und E563. Die zwei Glutaminsäurereste befinden sich an der Längsachse des STAT1-Dimers senkrecht zur DNA ausgerichtet. Durch ihre Anordnung scheinen sie die Wechselwirkung zwischen dem Lysinrest 567 und dem Phosphodiester-Rückgrat eines gebundenen GAS-Elementes zu erleichtern und stellen dadurch die Voraussetzung für eine transiente Geninduktion her.de
dc.description.abstractengSTAT proteins (signal transducers and activators of transcription) play an essential part in one of the oldest and highly conserved signal transduction pathways. The JAK-STAT pathway transmits signals from many cytokines arriving at the plasma membrane to the cell nucleus, resulting in a modulation of gene expression. STATs are involved in a variety of processes such as cell growth and immune responses. A key feature in gene induction by STAT proteins is the binding to specific palindrome sequences, known as gamma activated sites (GAS). Since the exact mechanisms of signal dependent target recognition by tyrosine phosphorylated STAT have not yet been thoroughly investigated, directed mutagenesis was used in this study to introduce point mutations in the STAT1 linker and DNA-binding domain. The resulting mutants were characterized functionally. Results showed that three critical amino acid residues in the STAT1 linker domain (E559, E563 and K567) are located in a homologous sequence pattern which is highly conserved among the seven STAT human proteins. Furthermore, these superficially exposed residues are located in close proximity to the bound DNA helix. Substitution of the conserved lysine residue at position 567 resulted in a loss of specific binding to high affinity GAS sites, as well as a complete lack in the transactivation of IFNγ-regulated endogenous target genes. However, the time course of transient nuclear accumulation and tyrosine phosphorylation did not differ from the kinetics of the wild-type molecule. These results demonstrated that the lysine residue at position 567 of the STAT1 linker do-main is required for GAS recognition. In addition, two glutamic acid residues at position E559 and E563 are important for the dissociation of the STAT1 dimer from DNA. The substitution of the glutamic acid residues led to an increased rate of tyrosine phosphorylation as well as prolonged cytokine-stimulated nuclear accumulation in IFNγ-treated cells. The point mutant K350A in the STAT1 DNA-binding domain did not provide any further information about molecular mechanisms of signal-dependent target gene recognition, since the mutant did not differ from the wild type protein. In conclusion, the data confirm the impact of the linker domain on signal-dependent GAS binding mediated by the steric arrangement of the glutamic acid residues E559 and E563 located on the inner surface of the STAT1 dimer. The two glutamic acid residues are aligned perpendicular to the DNA on the longitudinal axis of the STAT1 dimer. By this arrangement, the residues seem to facilitate the interaction between the lysine residue 567 and the phosphodiester backbone of the bound GAS element, thereby establishing the prerequisite for transient gene induction.de
dc.contributor.coRefereeKube, Dieter Prof. Dr.
dc.subject.gerSTAT1de
dc.subject.gerLinker-Domänede
dc.subject.gerGenexpressionde
dc.subject.gerInterferonde
dc.subject.gerDNA-Bindungde
dc.subject.engSTAT1de
dc.subject.engLinker Domainde
dc.subject.engGene Expressionde
dc.subject.engInterferonde
dc.subject.engDNA-Bindingde
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-002E-E319-6-6
dc.affiliation.instituteMedizinische Fakultätde
dc.subject.gokfullNachschlagewerke {Medizin} (PPN620300566)de
dc.description.embargoed2018-01-16
dc.identifier.ppn1010582747


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