Wood anatomy and cytokinin-related responses in poplar (Populus sp.) under environmental stress

von Shanty Paul
Kumulative Dissertation
Datum der mündl. Prüfung:2017-03-01
Erschienen:2018-02-09
Betreuer:Prof. Dr. Andrea Polle
Gutachter:Prof. Dr. Ivo Feußner
Gutachter:Prof. Dr. Christiane Gatz
Gutachter:Dr. Thomas Pd Teichmann
Gutachter:Prof. Dr. Christian Ammer
Gutachter:Prof. Dr. Konstantin Krutovsky
Zum Verlinken/Zitieren: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-6722

 

 

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Format:PDF
Description:Ph.D. dissertation by Shanty Paul. Title: Wood anatomy and cytokinin-related responses in poplar (Populus sp.) under environmental stress. Supervisor: Prof. Dr. Andrea Polle (Department of Forest Botany and Tree Physiology)

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Zusammenfassung

Englisch

Woody plants like poplar are of great importance as a second generation bioenergy crop. However, wood formation is dynamic and strongly affected by exogenous factors such as drought or seasonality, and endogenous factors. Drought negatively affects wood growth and results in significant changes in wood anatomy in poplar. But the intraspecific variations in drought-induced wood anatomical changes and the underlying molecular responses are not clear. In addition to the exogenous factors, endogenous factors such as the phytohormone, cytokinins affect wood formation. The analysis of cytokinin activity is of particular interest, as growth maintenance under unfavourable environmental conditions is the basis to increase poplar productivity. Our current knowledge about cytokinins comes mainly from studies of the herbaceous annual model plant, Arabidopsis thaliana, whereas a few studies have been conducted with woody model plant, poplar. For instance, the cytokinin levels differ between the season of active growth and dormancy and under drought. But the localization pattern of active cytokinins in different organs and cells in poplar is unknown. To address these research gaps, the goals of this study were: (1) Investigation of the presence and cellular localization pattern of active cytokinins in apical buds, leaves, along the stem and fine roots of Populus × canescens in the active growth phase and during dormancy. (2) Investigation of drought-induced changes of active cytokinins at tissue and cellular levels in different organs of P. × canescens and to compare the patterns with growth responses, physiological and morphological drought acclimation. (3) Analysis of the intraspecific variation in the drought-induced changes in wood anatomy in P. nigra and the molecular responses underlying them. (4) Analysis of the time dependent progress in drought-induced wood anatomical changes in P. nigra and to examine whether these changes are accompanied by changes in the transcript abundance of cytokinin signalling, biosynthesis and degradation genes in the transcriptome of developing xylem. To achieve the first goal, poplars transformed with ARR5::GUS reporter construct were tested for GUS staining. Lines with similar patterns of GUS activity were chosen and tested for cytokinin inducibility. Selected lines were grown outdoors for 1.5 years and used to monitor growth and GUS activity. The transgenic poplar lines “showed no influence of ARR5::GUS reporter construct on the growth performance compared with the wildtype, but one line lost the reporter activity during the time course of the study. ARR5::GUS activity indicated changes in the tissue- and cell type-specific pattern of cytokinin activity during dormancy compared with the growth phase. ARR5::GUS activity, which was present in the root tips in the growing season, disappeared in winter. In the stem apex ground tissue, ARR5::GUS activity was higher in winter than in summer. Leaf primordia in summer showed ARR5::GUS activity, but not the expanded leaves of outdoor plants or leaf primordia in winter. In stem cross sections, the most prominent ARR5::GUS activity was detected in the cortex region and in the rays of bark in summer and in winter. In the cambial zone, the ARR5::GUS activity was more pronounced in the dormant than in growth phase. The pith and the parts of ray cells associated with the vessels also displayed ARR5::GUS activity. In silico analyses of the tissue-specific expression patterns of the whole PtRR type-A family of poplar showed that PtRR10, the closest ortholog to the Arabidopsis ARR5 gene, was usually the most highly expressed gene in all tissues. In this study, gene expression and tissue-localization indicated high activity of cytokinins not only in summer, but also in winter. The presence of the signal in meristematic tissues supports their role in meristem maintenance.”* To meet the second goal, a mild drought treatment, which did not abolish growth completely, was applied to poplars transformed with ARR5::GUS reporter construct. “Young leaves showed strong cytokinin activity in the veins and low staining under drought stress, accompanied by diminished leaf expansion. Leaf scars, at positions where drought-shedding occurred, showed strong reduction of cytokinin activity. The pith in the differentiation zone of stem showed high cytokinin activity with distinct, very active parenchymatic cells and enhanced activity close to primary xylem. This pattern was maintained under drought but the cytokinin activity was reduced. Mature phloem parenchymatic cells showed high cytokinin activity and mature wood showed no detectable cytokinin activity. Cytokinin activity in the cambium was apparent as a clear ring, which faded under drought. Xylem-localized cytokinin activities were also mirrored by the relative expression of PtaRR3, whereas PtaRR10 showed developmental but no drought-induced changes. Primary meristems exhibited high cytokinin activity regardless of drought stress, supporting a function of this phytohormone in meristem maintenance, whereas declining cytokinin activities in apical pith tissues and cambium of drought-stressed poplars linked cytokinin in these cell types with the control of primary and secondary growth processes. Changes in cytokinin activity further imply a role in drought avoidance mechanisms of poplars, especially in the reduction of leaf area. ”† In order to reach the third goal, three Populus nigra genotypes originating from a dry, a mesic or a wet habitat were grown under control or drought-stressed conditions and wood anatomy was analyzed. “Drought resulted in reduced cambial activity, decreased vessel and fiber lumina, and increased the saccharification potential. The saccharification potential was unrelated to lignin content as well as to most wood anatomical traits. RNA sequencing of the developing xylem revealed that 1.5% of the analyzed genes were differentially expressed in response to drought, while 67% differed among the genotypes. Weighted gene correlation network analysis identified modules of co-expressed genes correlated with saccharification potential. These modules were enriched in gene ontology terms related to cell wall polysaccharide biosynthesis and modification and vesicle transport, but not to lignin biosynthesis. Among the most strongly saccharification-correlated genes, those with regulatory functions, especially kinases, were prominent. We further identified transcription factors whose transcript abundances differed among genotypes, and which were co-regulated with genes for biosynthesis and modifications of hemicelluloses and pectin.”# To meet the fourth goal, a five week moderate drought treatment was applied to P.nigra plants. The plants were harvested weekly and wood anatomy was analyzed. During the five weeks of drought treatment, radial growth, relative width of developing xylem, number of cambial cell layers and lumen area per fibre were significantly reduced when compared to the control plants. The other anatomical traits analyzed did not show a significant effect of drought. Regression analyses revealed significant positive correlations between radial growth and number of cambial cell layers, radial growth and relative width of the developing xylem, radial growth and lumen area per fibre, number of cambial cell layers and relative width of the developing xylem. Analysis on the transcript abundance of cytokinin response genes in the transcriptome of developing xylem revealed that the response regulators, RR7 and RR9, showed a significant decline under drought as well as with the duration of the experiment which suggested reduced cytokinin signalling under drought. Among the cytokinin biosynthetic genes, transcript abundance of IPT2, 5a and 5b showed variation with time and only marginal induction under drought. The transcript abundance of cytokinin degradation gene, CKX6 was significantly increased under drought. The analysis of transcript abundance of cytokinin related genes showed reduced cytokinin signalling and increased degradation under drought. As cytokinins are the central regulators of cambial development in poplar, this reduction in cytokinin signalling and levels may have resulted in the significantly reduced number of cambial layers and thereby bringing about significant changes in wood anatomy which will eventually help the plants in survival under drought. Transgenic poplars transformed with ARR5::GUS construct have been introduced for the first time in this study and used to shed light on tissue and cellular level cytokinin activity during active growth and dormancy, as well as in response to drought. Fine root tips, cambial cells and xylem rays were the main tissues that showed differences in cytokinin activity under varying environmental conditions studied here. The ARR5::GUS poplar “reporter lines can be used to investigate the involvement of cytokinins in mediating growth constraints and growth-promoting treatments for vascular development and cell type identities in the future. Thereby, these poplars may become an important tool to enhance our understanding of woody biomass production.”* * Paul S. et al. 2016. Frontiers in Plant Science 7: 652. † Paul S. et al. 2018 AoB PLANTS 10: plx067. # Wildhagen et al. 2017. Tree Physiology 24:1-20.
Keywords: Cytokinin; Wood anatomy; ARR5::GUS; Populus × canescens; Cytokinin localization; Dormancy; Drought; Cambium; Type-A RR; Biofuels; Genotypic variation; Wood traits; Response regulator

Deutsch

Die Holzgewächse, wie die Pappel, sind als Energiepflanzen zweiter Generation von großer Bedeutung. Die Holzbildung ist jedoch dynamisch und durch exogene Faktoren wie Trockenheit und Saisonalität stark beeinträchtigt als auch von endogenen Faktoren. Trockenheit beeinträchtigt das Holzwachstum negativ und führt zu signifikanten Veränderungen in der Holzanatomie der Pappel. Die intraspezifischen Variationen in der Holzanatomie, welche durch Trockenheit induziert werden und zu holzanatomischen Veränderungen führen, sowie die molekularen Antworten sind jedoch nicht klar. Neben den exogenen Faktoren wird die Holzbildung auch durch endogene Faktoren wie den Phytohormonen beeinträchtigt. Die Analyse der Cytokininaktivität ist von besonderem Interesse, weil die Erhaltung des Wachstums unter ungünstigen Umweltbedingungen die Basis für die Verbesserung der Pappelproduktion darstellt. Unser aktuelles Wissen über Cytokinine wird hauptsächlich von Studien über die krautige, einjährige Modellpflanze Arabidopsis thaliana, bezogen und nur wenige Studien wurden an der holzigen Modellpflanze, der Pappel, durchgeführt. Beispielszweise verändert sich das Level an Cytokinin zwischen der Phase des aktiven Wachstums und der Winterruhe sowie unter Trockenheit. Die Lokalisation von aktivem Cytokininen in den verschiedenen Organen und Zellen ist jedoch in der Pappel nicht bekannt. Um diese Lücke in der Forschung zu berücksichtigen, waren die Ziele dieser Studie folgende: (1) Die Untersuchung des Auftretens und der zellulären Lokalisation von aktiven Cytokininen in der Apikalknospe, den Blättern, den Feinwurzeln und entlang des Stammes in der aktiven Wachstumsphase und während der Ruhephase anhand von Populus × canescens. (2) Die Untersuchung der durch Trockenheit induzierten Veränderungen der aktiven Cytokinine im Gewebe und auf zellulärer Ebene verschiedener Organe von P. × canescens und der Vergleich von Mustern bezüglich Wachstumsreaktion sowie physiologische und morphologische Anspassungen unter Trockenheit. (3) Die Analyse in P. nigra von intraspezifischen Variationen in der durch Trockenheit induzierten Holzanatomie und der molekularen Reaktion, die diesem unterliegt. (4) Das Analysieren von Trockenheit induzierten Veränderungen der Holzanatomie anhand von P. nigra im zeitabhängigen Verlauf um aufzuzeigen, ob diese Veränderungen von der Transkripthäufigkeit von Genen des Cytokininsignals, der Biosynthese und der Zersetzung im Transkriptom des sich entwickelnden Xylems begleitet werden. Um das erste Ziel zu erreichen wurden Pappeln mit einem ARR5::GUS Reporter Konstrukt transformiert und mittels GUS Färbung getestet. Linien, welche ähnliche Muster der GUS Aktivität zeigten wurden ausgewählt und auf Cytokinininduzierbarkeit getestet. Die ausgewählten Linien wurden für 1,5 Jahre draußen wachsen gelassen und das Wachstum sowie die GUS Aktivität wurden beobachtet. Im Vergleich von transgenen Pappellinien mit dem Wildtyp wurde bezüglich ihres Wachstums kein Einfluss des ARR5::GUS Reporter Konstrukts beobachtet, jedoch verlor während der Zeitreihe der Studie eine Line die Reporter Aktivität. Während der Ruhephase im Vergleich zur Wachstumsphase traten durch die ARR5::GUS Aktivität Veränderungen im Gewebe- und Zelltyp spezifische Muster für Cytokinin Aktivität auf. ARR5::GUS Aktivität, welche in den Wurzelspitzen während der Wachstumsphase vertreten war, verschwand im Winter. ARR5::GUS Aktivität war im basalen Gewebe des Stammapexs im Winter höher als im Sommer. Blattanlagen zeigten im Sommer ARR5::GUS Aktivität, jedoch nicht die ausgebildeten Blätter der Pflanzen, die draußen standen oder Blattanlagen im Winter. Die markanteste ARR5::GUS Aktivität wurde in den Stammquerschnitten in der Kortexregion und, im Sommer sowie im Winter, in den Strahlenzellen der Rinde detektiert. Die ARR5::GUS Aktivität im Kambium war während der Ruhephase mehr ausgeprägt als in der Wachstumsphase. Das Mark sowie die mit dem Xylem verbundenen Strahlenzellen zeigten ebenfalls ARR5::GUS Aktivität. In silico Analysen des gewebespezifischen Expressionsmusters der ganzen PtRR type-A Familie der Pappel zeigte, dass PtRR10, das naheste ortholog zum Arabidopsis ARR5 Gen, für gewöhnlich am höchsten exprimierte Gen war. Durch diese Studie wurde gezeigt, dass Genexpression und Gewebelokalisation hohe Cytokininaktivität nicht nur im Sommer, sondern auch im Winter zeigt. Die Rolle von Cytokinin zur Erhaltung des Mersitems wird durch die Signalpräsenz im meristematischen Gewebe unterstützt. Um das nächste Ziel zu erreichen, einen milden Trockenstress, welches das Wachstum nicht komplett zum Stillstand bringt, wurden transformierten Pappeln mit dem ARR5::GUS Reporter Konstrukt genutzt. Junge Blätter zeigten starke Cytokininaktivität im Geäder und schwache Färbung unter Trockenstress begleitet von vermindertem Blattwachstum. Blattnarben an denen trockeninduzierter Blattverlust auftrat, zeigten eine starke Reduktion von Cytokinaktivität. Das Mark in der Differenzierungszone des Stammes zeigte hoche Cytokininaktivität mit eindeutingen, sehr aktiven Parenchymzellen und verbessertet Aktivität nahe am primären Xylem. Dieses Muster wurde under Trockenheit erhalten, aber die Cytokininaktivität war reduziert. Reifes Phloemparenchym zeigte hohe Cytokininaktivität während im reifen Holz keine Cytokininaktivität detektierbar war. Das Kambium war durch einen klaren Ring offensichtlich, welcher unter Trockenheit verblasste. Die Cytokininaktivitätk, welche im Xylem lokalisiert wurde, wurde auch durch relative Expression von PtaRR3 bestätigt, wohingegen PtaRR10 sich entwickelnde aber nicht signifikante Trockenheit induzierte Veränderungen zeigte. Primäre Meristeme wiesen trotz Trockenstress hohe Cytokininaktivität auf, was eine Meristem erhaltende Funktion dieses Phytohormons unterstützt. Eine sinkende Cytokininaktivität im apikalen Markgewebe und Kambium bei Pappeln unter Trockenstress verbinden Cytokinin, hingegen, in diesen Zelltypen mit der Kontrolle von primären und sekundären Wachstumsprozessen. Veränderungen in der Cytokiniaktivität implizieren eine Rolle von Trockenheit vermeidenen Mechanismen der Pappel insbesondere in der Reduktion von Blattfläche. Um das dritte Ziel zu erreichen, wurden drei Populus nigra Genotypen, die aus einem trockenen, einem mäßigen und einem feuchten Habitat stammen, unter Kontroll- und Trockenstress-Bedingungen angezogen und die Holzanatomie analysiert. Trockenheit führte zu reduzierter kambischer Aktivität, zu verminderter Gefäß- und Faserweite und zur gesteigerten Saccharifizierung. Zwischen dem Potential der Saccharifizierung und dem Ligningehalt sowie den meisten holzanatomischen Eigenschaften konnte kein Bezug festgestellt werden. Durch die RNA-Sequenzierung des entwickelnden Xylems zeigte sich, dass 1,5 % der analysierten Gene unterschiedlich unter Trockenheit exprimiert waren (DDEGs), während 67 % sich zwischen den Genotypen unterschieden (GDEGs). Durch die WGCNA (weighted gene correlation network analysis) wurden Module identifiziert, welche koexprimierte Gene enthielten, die mit dem Saccharifizierungsptential korrelierten. Diese Module bestanden hauptsächlich aus GO (gene ontology) Begriffen, welche im Zusammenhang mit der Biosynthese von Zellwandpolysacchariden, Modifizierung und Vesikeltransport stehen, jedoch aber nicht mit Ligninbiosynthese. Besonders Gene mit Regulationsfunktionen befanden sich unter den am stärksten sacchafizeriungskorrelierten Genen. Dabei wareninsbesondere Kinasen sehr auffällig. Des Weiteren wurden Transkriptionsfaktoren identifiziert, die eine unterschiedliche Transkripthäufigkeit zwischen den Genotypen zeigten und zudem, mit Genen der Biosynthese und Modifikation von Hemizellulosen und Pektinenkoreguliert waren. Für das vierte Ziel wurde moderater Trockenstress für fünf Wochen an P. nigra Pflanzen angewandt. Die Pflanzen wurden wöchentlich geerntet und die Holzanatomie analysiert. Während der fünf Wochen Trockenheitsbehandlung wurden Radialwachstum, relative Weite des entwickelnden Xylems, Anzahl an kambialen Zelllagen und Lumenareal pro Gefäß, verglichen mit den Kontrollpflanzen, signifikant reduziert. Die anderen analysierten anatomischen Merkmale zeigten keinen signifikanten Trockenheitseffekt. Regressionsanalysen deckten signifikante positive Korrelationen zwischen Radialwachstum und Anzahl an kambialen Zelllagen, Radialwachstum und relativer Weite des entwickelnden Xylems, Radialwachstum und Lumenareal pro Gefäß und zwischen Anzahl an kambialen Zelllagen und relativer Weite des entwickelnden Xylems auf. Eine Analyse der Transkript-Abundanzen von Cytokinin-Antwort-Genen im Transkriptom des entwickelnden Xylems zeigte auf, dass die Antwort-Regulatoren RR7 und RR9 eine signifikante Reduzierung sowohl unter Trockenstress zeigten, als auch mit der Dauer des Experiments, was eine reduzierte Cytokinin-Signalübertragung unter Trockenheit vermuten lässt. Unter den Cytokinin-Biosynthese-Genen zeigten die Transkript-Abundanzen von IPT2, 5a und 5b Variationen mit der Zeit und nur marginale Induktion bei Trockenheit. Die Transkript-Abundanz des Cytokinin-Degradation-Gens CKX6 war bei Trockenheit signifikant erhöht. Die Analyse der Transkriptabundanzen von mit Cytokinin im Zusammenhang stehenden Genen zeigte eine reduzierte Cytokinin-Signalübertragung und erhöhte Degradierung bei Trockenheit. Da Cytokinine die zentralen Regulatoren der kambialen Entwicklung in Pappeln sind, könnte diese Reduktion der Cytokinin-Signalübertragung und -Level zur signifikant reduzierten Anzahl an kambialen Lagen geführt und damit signifikante Änderungen in der Holzanatomie bedingt haben, die den Pflanzen letztendlich helfen bei Trockenheit zu überleben. Transgene Pappeln, transformiert mit dem ARR5::GUS Reporter Konstrukt wurden in dieser Studie zum ersten Mal bekannt gemacht und eingesetzt, um die Cytokinin-Aktivität auf Gewebe- und Zellebene während des aktiven Wachstums, während der Dormanz, und auch als Antwort auf Trockenheit zu beleuchten. Die hauptsächlichen Gewebe, welche Unterschiede in ihrer Cytokininaktivität unter den hier untersuchten verschiedenen Umweltbedingungen aufwiesen, waren Feinwurzeln, Kambium und Strahlenzellen. Die ARR5::GUS Pappel Reporter Linien können genutzt werden, um zukünftig die Beteiligung von Cytokininen an der Vermittlung von Wachstumszwängen und wachstumsfördernden Behandlungen für die vaskuläre Entwicklung und die Zelltypen-Identität zu erforschen. Dabei könnten diese Pappeln ein wichtiges Mittel werden, um unser Verständnis der Produktion an Holzbiomasse zu steigern.
 
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