| dc.contributor.advisor | Hell, Stefan Prof. Dr. | |
| dc.contributor.author | Loidolt-Krüger, Maria | |
| dc.date.accessioned | 2018-05-18T07:11:57Z | |
| dc.date.available | 2018-05-18T07:11:57Z | |
| dc.date.issued | 2018-05-18 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-002E-E3ED-8 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-6860 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-6860 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-6860 | |
| dc.language.iso | eng | de |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ | |
| dc.subject.ddc | 571.4 | de |
| dc.title | STED Microscopy of FRET Pairs | de |
| dc.type | doctoralThesis | de |
| dc.contributor.referee | Hell, Stefan Prof. Dr. | |
| dc.date.examination | 2018-03-19 | |
| dc.description.abstractger | Der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein beliebtes Werkzeug der Lebenswissenschaften.
Er wird z.B. benutzt um Proteininteraktionen oder das Binden von Liganden
zu detektieren, oder um fluoreszente Biosensoren für Stoffwechselprodukte oder
Ionen zu konstruieren. Es wäre vorteilhaft, solche funktionellen Informationen, wie
man sie durch FRET erhält, aus hochaufgelösten Bildern auslesen zu können. Zum
einen würde die räumliche Mittelung der Fluoreszenzsignale durch ein kleineres Detektionsvolumen
reduziert werden. Zum anderen könnten FRET-Signale aus dicht
beieinander liegenden Zonen, die kleiner als die Beugungsgrenze sind, voneinander unterschieden
werden. Daher war es das Ziel dieser Dissertation, die Durchführbarkeit von
FRET-Messungen mittels STED-Mikroskopie (STED - Stimulated Emission Depletion)
zu prüfen.
Numerische Simulationen eines einzelnen FRET-Paares unter Dauerstrich- und gepulster
STED-Beleuchtung wurden durchgeführt, um das Zusammenspiel der photophysikalischen
Prozesse FRET und STED zu untersuchen, den Einfluss der STED-Laserintensität
und der Pulsverzögerung mit eingeschlossen.
Organische Fluorophore wurden getestet, um ein mit STED kompatibles FRET-Paar zu
identifizieren; die Farbstoffe Atto532 und Star635P wurden für die weiteren Experimente
ausgewählt. Fluoreszenzlebensdauer-STED-Mikroskopie einzelner FRET-Paare,
die in bestimmten Abständen an doppelsträngiger DNA befestigt waren, wurde mit
verschiedenen STED-Laserleistungen und STED-Pulsverzögerungen durchgeführt. Auf
diese Weise gemessene Fluoreszenzlebensdauerhistogramme wurden mit simulierten
Histogrammen verglichen, um die Gültigkeit des vereinfachten photophysikalischen
Modells zu testen, welches entwickelt wurde, um den Messprozess zu beschreiben.
Basierend auf diesem Modell wurde die Messstrategie entworfen und die Messeinstellungen
gewählt. Die spektralen Detektionskanäle des Donor-, FRET- und Akzeptorsignals
unterscheiden sich in der räumlichen Auflösung, dies schließt die Verwendung
intensitätsbasierter FRET-Quantifizierungsmethoden aus. Nur die Analyse der
Fluoreszenzlebensdauerhistogramme des Akzeptors kann beugungsunbegrenzte FRETInformationen
liefern.
Große spektrale Verschiebungen der Fluoreszenz beider Fluorophore wurden in Einzelmolekülmessungen
beobachtet. In STED-Bildern zeigte sich, dass eine Verschiebung
der Emission hin zu kürzeren Wellenlängen die STED-Effizienz verringern kann und
damit auch die Auflösung der Bilder. Die spektralen Verschiebungen ändern auch das
spektrale Überlappintegral von Donoremission und Akzeptorabsorption und dadurch
die FRET-Effizienz; die Größe dieses Effekts wurde abgeschätzt.
vi
Kurz zusammengefasst wurde ein photophysikalisches Modell für die Interferenz von
STED und FRET eingeführt. Experimentelle Voraussetzungen für die STED-Mikroskopie
von FRET-Paaren wurden identifiziert und eine adäquate Datenanalysestrategie wurde
vorgeschlagen. Zusätzlich wurde die Photoumwandlung organischer Fluorophore
charakterisiert und deren Auswirkung auf STED und FRET untersucht. | de |
| dc.description.abstracteng | Förster resonance energy transfer (FRET) is a popular tool in life sciences, for example
to detect protein-protein interactions and ligand binding, or to construct fluorescent
biosensors for metabolites or ions. Obtaining such functional information provided by
FRET from diffraction-unlimited images would be advantageous, because, for one thing,
the spatial averaging of fluorescence signals could be reduced with a smaller detection
volume, and, for another thing, FRET signals from neighboring subdiffraction areas
could be distinguished. Thus, the goal of this thesis was to investigate the feasibility of
measuring FRET using stimulated emission depletion (STED) microscopy.
Numerical simulations of a single FRET pair under continuous-wave and pulsed STED
illumination were performed to study the interplay of FRET and STED photophysics,
including the influence of STED intensity and pulse delay.
Organic fluorophores were screened to identify a STED-compatible FRET pair, and the
dyes Atto532 and Star635P were chosen for further experiments. Fluorescence lifetime
imaging (FLIM) STED microscopy of single FRET pairs bound to dsDNA at defined
distances was performed with various STED laser powers and STED pulse delays. Thus
measured fluorescence decay curves were compared with simulated ones to confirm
the validity of the simplified photophysical model that was established to describe the
measurement process. Based on this model, the measurement strategy was devised and
the measurement settings were chosen. The spectral detection channels of donor, FRET
and acceptor signals differ in spatial resolution; this excludes the use of intensity-based
FRET quantification methods. Only the analysis of acceptor fluorescence decay curves
can yield diffraction-unlimited FRET information.
Large spectral shifts of the fluorescence emission of both fluorophores were observed in
single-molecule measurements. STED imaging showed that emission shifts to shorter
wavelengths can decrease the STED efficiency and thus the image resolution. The
spectral shifts also change the spectral overlap integral of donor emission and acceptor
absorption and thereby the FRET efficiency; the magnitude of this effect was
estimated.
In summary, a photophysical model for the interference of STED and FRET was established.
Experimental requirements for STED imaging of FRET pairs were identified and
a suitable data analysis strategy was proposed. Additionally, photoconversion of organic
fluorophores was characterized and its effect on STED and FRET investigated. | de |
| dc.contributor.coReferee | Köster, Sarah Prof. Dr. | |
| dc.subject.eng | Microscopy | de |
| dc.subject.eng | STED | de |
| dc.subject.eng | FRET | de |
| dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-002E-E3ED-8-2 | |
| dc.affiliation.institute | Göttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften, Biophysik und molekulare Biowissenschaften (GGNB) | de |
| dc.subject.gokfull | Biologie (PPN619462639) | de |
| dc.identifier.ppn | 1022548190 | |