| dc.contributor.advisor | Knorr, Christoph Prof. Dr. | |
| dc.contributor.author | Schütt, Raphael Oliver | |
| dc.date.accessioned | 2018-07-17T08:39:18Z | |
| dc.date.available | 2018-07-17T08:39:18Z | |
| dc.date.issued | 2018-07-17 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-002E-E44F-6 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-6961 | |
| dc.language.iso | deu | de |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ | |
| dc.subject.ddc | 630 | de |
| dc.title | Tube-Pellets als Alternative zur konventionellen Kryokonservierung | de |
| dc.type | doctoralThesis | de |
| dc.title.translated | Tube-Pellets as an Alternative to conventionally Cryopreservation | de |
| dc.contributor.referee | Knorr, Christoph Prof. Dr. | |
| dc.date.examination | 2018-02-13 | |
| dc.description.abstractger | Seit Einführung der genomischen Selektion arbeiten Besamungsstationen mit genomisch wertvollen Jungbullen ab einem Alter von 10 Monaten im regelmäßigen Sprungeinsatz (MELBAUM et al., 2016). Jungbullen haben ein reduziertes Ejakulatvolumen mit einer niedrigeren Spermienkonzentration im Vergleich zu einem Altbullen (WEITZE, 2001). Ungeachtet der steigenden Nachfrage ist die Herstellung von geschlechtsspezifisch differenzierten Besamungsportionen trotz technischer Innovationen weiterhin zeit-intensiv und kostspielig (SEIDEL, 2007). Um die Nachfrage nach Jungbullen der Spit-zengenetik und gesexten Besamungsportionen befriedigen zu können, muss entweder mit einer höheren Tierzahl gearbeitet oder die Spermienanzahl in der einzelnen Besa-mungsportion reduziert werden.
Folglich war das Ziel dieser Arbeit die Entwicklung eines praxistauglichen Verpa-ckungssystems, welches es ermöglicht unsortierte und geschlechtsspezifisch differen-zierte Spermien in niedrigen Volumina von 20-60 µl als einzeln identifizierbare und lagerfähige Besamungsportionen einzufrieren. Die Minimalvolumina sollten dabei die qualitativen Anforderungen der konventionellen Einfriertechnik im 250 µl Straw nach dem Auftauen erfüllen. Die Qualität der Besamungsportionen wurde im Labor mittels Thermoresistenztest überprüft.
Die Arbeit war in zwei Versuchsteile gegliedert, wobei für alle Versuchsteile eine un-sortierte konventionelle Besamungsportion mit 15x106 Spermien pro Straw als Kontrolle diente. Im Versuchsteil I wurden drei verschiedene unsortierte Minimalvolumina (20 µl Nanostraw mit 66x105, 30 µl Tube-Pellet mit 1x106 und 50 µl Tube-Pellet mit 1,66x106 Spermien) auf ihre Einfriertauglichkeit hin untersucht, wobei nativ und nach dem Auftauen die spermatologischen Untersuchungsparameter Motilität (CASA), Membranintegrität (SYBR®14 /PI-Färbung) und Morphologie (Phasenkontrastmikro-skop) ermittelt wurden. Es wurden zwei Jungbullen getestet. Im Versuchsteil II wurden zwei sortierte Minimalvolumina (30 µl Tube-Pellet mit 1x106 und 60 µl Tube-Pellet mit 2x106 Spermien) von einem Alt- und zwei Jungbullen untersucht, bei denen der Sort-Straw (160 µl mit 3,3x106 Spermien) als Kontrolle für die Einfrierbarkeit sortierter Spermien fungierte. Zusätzlich wurde der „post Sort“ Wert ermittelt. Alle Behand-lungsgruppen der Versuchsteile I und II wurden mit dem zweiphasigen Tiefgefrierme-dium Sexcess® (Masterrind, Verden, Deutschland) verdünnt.
Versuchsteil I: Bulle A erfüllte die Mindestanforderungen nach dem Auftauen (RATH et al., 2009) mit allen Behandlungsgruppen zur Stunde 0 und 6. Über den gesamten Messzeitraum gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrolle, dem 50 µl Tube-Pellet und dem 30 µl Tube-Pellet. Bulle B hatte die wesentlich schlechteren Ausgangswerte in den nativen Ejakulaten, erfüllte aber auch die Mindestanforderungen der Motilität nach dem Auftauen mit allen Behandlungsgruppen. Bei der Membranin-tegrität und der Morphologie lag er unter den Mindestanforderungen, im Vergleich zu anderen Studien jedoch in einem vergleichbar akzeptablen Rahmen (SEHNER, 2005).
Versuchsteil II: Der Wert des gesexten Spermas direkt nach dem Sortierprozess (post-Sort Wert) von Bulle A war signifikant (P≤0,05) höher, als die Nativprobe. Über die Messdauer des Thermoresistenztests kam es zu keinen signifikanten Motilitätsunter-schieden zwischen dem Kontrollstraw, dem Sort-Straw und dem 30 µl Tube-Pellet. Die Proben des Bullen C ließen sich sortiert weniger gut einfrieren - der unsortierte Kon-trollstraw war den sortierten Behandlungsgruppen zur Stunde 3 (Ausnahme war das 30 µl Tube-Pellet) und 6 überlegen (P≤0,05). Bei der Membranintegrität unterschieden sich der Kontrollstraw, der Sort-Straw und das 30 µl Tube-Pellet über den gesamten Messzeitraum der Membranintegrität nicht signifikant voneinander. Bulle C hatte zur Stunde 0 und 3 keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Kontrollstraw, dem Sort-Straw und dem 30 µl Tube-Pellet. Die Werte der morphologisch intakten Spermien beider Bullen entsprachen den Mindestanforderungen. Die ermittelten Motilitätswerte des Bullen D waren im Kontrollstraw und 30 µl Tube-Pellet zur Stunde 0 besser (P≤0,05) als das 60 µl Tube-Pellet und zu den Stunden 3 und 6 signifikant besser (P≤0,05) als der Sort-Straw und das 60 µl Tube-Pellet. Bei der Membranintegrität war der Kontrollstraw zwar dem Sort-Straw und den beiden sortierten Minimalvolumina zu allen Messzeitpunkten statistisch überlegen (P≤0,05), allerdings bestand kein statisti-scher Unterschied zwischen dem Sort-Straw und dem 30 µl Tube-Pellet. Bei der Mor-phologie gab es zu den drei Messzeitpunkten des Thermoresistenztests keine statisti-schen Unterschiede zwischen dem Kontrollstraw, dem Sort-Straw und dem 30 µl Tube-Pellet.
Durch die genomische Selektion und der kontinuierlichen Nachfragesteigerung nach geschlechtsspezifisch differenzierten Besamungsportionen genetisch wertvoller Tiere, besteht ein Interesse daran, die Spermienanzahl in der Besamungsportion zu reduzieren (DEN DAAS et al., 1998). Vor allem mit dem 30 µl Tube-Pellet konnte gezeigt werden, dass bovine Spermien in kleinen Volumina kryokonserviert und mit hoher Vitalität auf-getaut werden können. Abgesehen von dem 60 µl Tube-Pellet, welches für die Kryo-konservierung von gesorteten Spermien eingesetzt wurde, haben die untersuchten Mi-nimalvolumina der sortierten und unsortierten 30 µl Tube-Pellets, der unsortierten 20 µl Nanostraws und des unsortierten 50 µl Tube-Pellets ihre Einfriertauglichkeit unter Be-weis gestellt. | de |
| dc.description.abstracteng | Since the introduction of the genomic selection, insemination centers are function with genomically proofed young bulls at the age of 10 months onwards (MELBAUM et al., 2016). Young bulls have a reduced ejaculate volume with a lower sperm number com-pared to older bulls (WEITZE, 2001). Despite the growing demand on sexed sorted se-men, it is still a time-intensive and costly technique (SEIDEL, 2007). In order to be able to comply the demand for insemination doses of young bulls with high genomically potential and for sexed sorted semen - either a higher number of animals must be used or the number of sperm in the individual seizure portion should be reduced.
The aim of this work was the development of a practical packaging system, which al-lows the freezing of unsorted and sorted sperm in low volumes of 20-60 μl as individu-ally identifiable and storable insemination portions. The minimum volumes should achieve the qualitative requirements of the conventional freezing technique in 250 μl straws after thawing. The quality of the insemination doses was checked in the laborato-ry by performing a thermo-tolerance-test.
The work was divided into two parts. An unsorted 250 µl Straw with 15x106 sperm served as a control for all experimental parts. In experiment I, three different unsorted minimum volumes (20 μl Nanostraw with 66×105, 30 μl Tube Pellet with 1x106 and 50 μl Tube Pellet with 1,66×106 sperm) were examined for their deep freezing capacity. The spermatological parameters motility (CASA), membrane integrity (SYBR®14 / PI staining) and morphology (phase contrast microscopy) were tested native and after thawing. Two young bulls were tested. In the experimental part II, two sorted mini-mum volumes (30 μl Tube-Pellet with 1x106 and 60 μl Tube-Pellet with 2x106 sperm) were examined for one old and two young bulls. The sorted straw (160 μl with 3,3x106 sperm) served as a control for the freezeability of sorted sperm of the used bulls. In ad-dition, the post-sort value was determined. All treatment groups of booth experimental parts were diluted with the two-phase freezing medium Sexcess® (Masterrind, Verden, Germany).
Experiment I: Bull A achieved the minimum thawing requirements (RATH et al., 2009) with all treatment groups at 0 h and 6 h. Over the entire measurement period there were no significant differences between the control, the 50 μl Tube-Pellet and the 30 μl Tube-Pellet. Bull B had lower initial semen quality values, but also fulfilled the minimum requirements of the motility after thawing with all treatment groups. In the case of membrane integrity and morphology, it was below the minimum requirements, but compared to other studies in a comparable acceptable framework (SEHNER, 2005).
Experiment II: The value of the sexed sorted sperm immediately after the sorting pro-cess (post-sort value) (90.4±2.9 %) of bull A was significantly (P≤0.05) higher than the native sample (72.4±6.2 %). During a the thermo-tolerance-test there was no significant difference in motility between the control straw, the sort-straw, and the 30 μl Tube-Pellet. The sorted samples of bull C did not freeze well in comparison to the other bulls. The unsorted control straw was superior to the sorted treatment groups at 3 h (except for the 30 μl Tube-Pellet) and 6 h (P≤0.05). The membrane integrity of the control straw, of the sort-straw and of the 30 μl Tube-Pellet did not differ significantly from each other over the entire measurement period. Bull C showed no significant differences between the control straw, the sort-straw and the 30 μl Tube-Pellet at 0 h and 3 h. The values of the morphologically intact sperm of both bulls corresponded to the minimum require-ments. The motility of bull D in the control straw and the 30 µl Tube-Pellet were signif-icantly better (P≤0.05) than the 60 μl Tube-Pellet at 0 h (P≤0.05). After 3 h and 6 h the control straw and the 30 µl Tube-Pellet were significantly better (P≤0,05) compared to the sort-straw and the 60 μl Tube-Pellet. The membrane integrity of the control straw was superior (P≤0.05) to the sort-straw and the two sorted minimum volumes at all measurement times, but there was no difference between the sort straw and the 30 μl Tube-Pellet. Sperm morphology was not different between the control straw, the sort-straw, and the 30 μl Tube-Pellet at the three time points of measurement.
Due to the genomic selection and a continuous increase demanding sexed sorted insem-ination doses of genetically valuable bulls there has always been an interest in reducing sperm numbers (Den Daas et al., 1998). In this experiment, especially the 30 μl Tube-Pellet was proven to allow successful semen preservation in small volumes and sperm had high vitality after freezing and thawing. Apart from the 60 μl Tube-Pellet the mini-mum volumes tested for the sorted and unsorted 30 μl Tube-Pellets, the unsorted 20 μl Nanostraws and the unsorted 50 μl Tube-Pellets have demonstrated their freezing prop-erties. | de |
| dc.contributor.coReferee | Rath, Detlef Prof. Dr. | |
| dc.contributor.thirdReferee | Hummel, Jürgen Prof. Dr. | |
| dc.subject.ger | Kryokonservierung | de |
| dc.subject.ger | Geschlechtsspezifisch differenzierte Spermien | de |
| dc.subject.eng | Cryopreservation | de |
| dc.subject.eng | sexed sorted sperm | de |
| dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-002E-E44F-6-1 | |
| dc.affiliation.institute | Fakultät für Agrarwissenschaften | de |
| dc.subject.gokfull | Land- und Forstwirtschaft (PPN621302791) | de |
| dc.identifier.ppn | 1027040195 | |