Influence of point mutations on the electrophysiological properties of a bacterial porin and its interaction with a β-lactam antibiotic

von Annika Bartsch
Dissertation
Datum der mündl. Prüfung:2018-07-12
Erschienen:2018-09-19
Betreuer:Prof. Dr. Claudia Steinem
Gutachter:Prof. Dr. Claudia Steinem
Gutachter:Prof. Dr. Ulf Diederichsen
Zum Verlinken/Zitieren: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-7049

 

 

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Zusammenfassung

Englisch

The high rate of complications and mortality in hospitals due to multidrug resistances (MDR) of gram-negative bacteria demonstrates the urgency to understand the underlying mecha-nisms. One common cause of MDR are mutations in bacterial porins, which are β-barrel pro-teins responsible for the uptake of antibiotics through the outer bacterial membrane. They have a periplasmic and an extracellular side, which are separated by the constriction region (CR) in the center of the pore. The CR is the narrowest point of the pore and a key region for antibiotic binding and permeation. Upon mutations in this region, the interaction between porin and antibiotic can be altered, leading to an impaired antibiotic permeation and thus increasing resistance. In this work, the influence of mutations of the major porin PorB of Neisseria meningitidis on the interaction with the β-lactam antibiotic ampicillin was investigated using the planar patch-clamp technique supported by molecular dynamics (MD) simulations. In electrophysi-ology, the interaction between channel and substrate can be detected by short blockages of the open channel conductance, caused by a bound molecule. Examining the mutants G103K and G103D allowed analyzing the effect of a large residue and an additional positive (G >K) or negative charge (G >D) at the CR on the electrophysiological properties of the pores and the interaction with ampicillin. First, the electrophysiological properties of PorB wild type (wt) and the mutants were char-acterized in absence of ampicillin. A strong reduction of the open channel conductance upon the mutation G >K was found, whereas the mutation G >D only had a small influence. The alteration of the pore’s inner electric field due to the mutation G¬ >K is a probable cause for this finding. The open channel noise, however, was strongly increased due to the mutation G >D, supposedly due to additional electrostatic repulsions of the negative charges at the CR. The electrophysiological measurements in the presence of ampicillin showed an interaction of ampicillin with PorB wt and the mutant G103K, but not with the mutant G103D, which can be rationalized by a destabilization of the ampicillin binding site due to the increased elec-trostatic repulsion at the CR. Thus, the interaction with ampicillin was only compared be-tween PorB wt and PorB G103K. Ampicillin blocks the PorB channels only when added to their extracellular sides. Together with the asymmetric location of the binding site at the extracellular side found by MD simula-tions, this suggests a high energy barrier for ampicillin entering from the periplasmic side. Ampicillin is bound longer in the G103K pore than in the PorB wt pore and is more often re-leased back to the extracellular lumen, indicating a higher energy barrier for ampicillin per-meation through the mutant than through the wild type. This is ascribed to the different ori-entations ampicillin adopts upon entering the CR of the two porins. Hence, the mutation G >K substantially alters the interaction between PorB and ampicillin and probably reduces its permeation.
Keywords: Porin; antibiotics; electrophysiology

Deutsch

Die hohe auf multiresistente Keime zurückzuführende Komplikations- und Sterblichkeitsrate in Krankenhäusern verdeutlicht die Dringlichkeit, die zugrunde liegenden Mechanismen zu verste-hen. Eine häufige Ursache von Multiresistenzen sind Mutationen von Porinen, welche für den Transport von Antibiotika in die Zellen von gram-negativen Bakterien verantwortlich sind. Porine sind β-Fässer mit einem peripasmischen und einem extrazellulären Zugang, welche durch die soge-nannte Konstriktionszone (constriction region, CR) in der Mitte der Pore getrennt sind. Die CR ist die engste Stelle der Pore und spielt eine entscheidende Rolle in Bezug auf Anbindung und Trans-port von Antibiotika. Durch Mutationen in dieser Region kann die Wechselwirkung zwischen An-tibiotikum und Pore in einem Maß verändert werden, welches den Transport beeinträchtigt und somit die Resistenz des Bakteriums erhöht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss von Mutationen des Porins PorB aus Neisseria menin-gitidis auf die Wechselwirkung mit dem β-lactam Antibiotikum Ampicillin mittels planarer Patch-Clamp Technik untersucht und durch Molekulardynamik (MD) Simulationen unterstützt. In elekt-rophysiologischen Messungen kann die Wechselwirkung zwischen Kanal und Substrat durch kurze Blockaden des Kanalstroms, verursacht durch ein angebundenes Substrat, detektiert werden. Mit-tels der Mutanten G103K und G103D konnte der Effekt eines großen Restes und einer zusätzlichen positiven (G->K) oder negativen (G->D) Ladung in der CR auf die elektrophysiologischen Eigen-schaften der Pore und die Interaktion mit Ampicillin untersucht werden. Zunächst wurden die elektrophysiologischen Eigenschaften von PorB Wildtyp (wt) und den Mu-tanten ohne Ampicillin charakterisiert. Infolge der Mutation G->K wurde eine starke Verringerung der Kanalleitfähigkeit gefunden, wohingegen die Mutation G->D nur einen geringen Einfluss hat. Eine Modifikation des inneren elektrischen Feldes der Pore aufgrund der Mutation G >K ist die wahrscheinlichste Ursache. Ein erhöhtes Rauschen des offenen Kanals wurde hingegen nur bei der Mutante G103D detektiert und wird auf eine zusätzliche Abstoßung negativer Ladungen in der CR zurückgeführt. Die elektrophysiologischen Messungen mit Ampicillin zeigten nur im Falle von PorB wt und G103K eine Blockade der Kanalleitfähigkeit, jedoch nicht für PorB G103D. Dies kann durch eine Destabili-sierung der Bindungsstelle aufgrund der zusätzlichen Abstoßung der negativen Ladungen in der CR begründet werden. Entsprechend wurde die Wechselwirkung mit Ampicillin nur zwischen PorB wt und G103K verglichen. Ampicillin blockiert den PorB Kanal nur, wenn es auf der extrazellulären Seite des Porins zugege-ben wird. In Kombination mit der mittels MD Simulationen nachgewiesenen asymmetrischen Lage der Ampicillin-Bindungsstelle auf der extrazellulären Seite, spricht dies für eine hohe Energiebarri-ere für von der periplasmischen Seite eintretendes Ampicillin. In der Mutante ist Ampicillin länger gebunden und wird häufiger zurück zum extrazellulären Lumen entlassen. Dies lässt auf eine höhe-re Energiebarriere für die Permeation von Ampicillin durch G103K als durch PorB wt schließen und wird den unterschiedlichen Orientierungen, die Ampicillin beim Eintritt in die Konstriktions-zone der beiden Porine einnimmt, zugeschrieben. Folglich beeinflusst die Mutation G >K die Wechselwirkung zwischen PorB und Ampicillin und vermindert vermutlich dessen Permeation durch das Porin.
 
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