Proteomics of Aspergillus nidulans sexually differentiated cells

by Benedict Dirnberger
Doctoral thesis
Date of Examination:2018-07-04
Date of issue:2018-10-01
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Stefanie Pöggeler
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-7066

 

 

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Abstract

English

The homothallic mold Aspergillus nidulans produces as overwintering structures closed sexual fruiting bodies named cleistothecia, which contain ascospores as products of meiosis. Formation of fruiting bodies is linked to a specific secondary metabolism and includes a number of specialized cells like the globose-thick walled multinuclear Hülle cells. The LaeA methyltransferase represents an epigenetic regulator of numerous secondary metabolite clusters and is required for Hülle cell formation. Abolished Hülle cell formation correlates with a significantly reduced size of the cleistothecia, which suggested a nursing function of these cells for the growing fruiting body. In this work, proteomes of fungal cells from different developmental programs and from enriched fractions of Hülle cells were compared to colonies grown on surfaces or in liquid medium. In a quantitative proteomics approach these results were compared to vegetative mycelia lacking the methyltransferase LaeA resulting in reduced Hülle cell formation and reduced secondary metabolism linked to the sexual program. Comparative proteomics in combination with fluorescence microscopic investigations showed that the prenyltransferase XptB and other proteins encoded by the monodictyphenone (mdp) / xanthone (xpt) secondary metabolite gene clusters are found in sexual mycelium as well as in Hülle cells grown on surfaces or in submerged liquid cultures. NptA represents a second prenyltransferase, which could be identified in different fungal cell types including Hülle cells and quantitative proteomics revealed that the protein quantity of NptA is down-regulated in strains lacking LaeA. Hülle cells grown on surfaces compared to liquid culture shared approximately 72% of the identified proteins in a core proteome. Besides the mdp/xpt protein, the ankyrin domain protein (AN8434) and the tryrosine domain protein (AN8435) are part of the core proteome and showed in fluorescence microscopic investigations a cellular localization in Hülle cells. In contrast to Hülle cells derived from liquid culture, surface cells contained increased numbers of glucanase protein levels. Another specific protein, which was only identified in surface and not liquid Hülle cells was the maltose permease-like transporter of Hülle cells MphA. Genetic studies of the corresponding deletion strain revealed that the MphA protein, which is enriched in surface Hülle cells, promotes fungal growth, asexual and sexual development.
Keywords: Aspergillus nidulans; Hülle cells; Proteomics; SILAC; Sexual development; Cleistothecium; laea methyltransferase; Hyphae development; Sexual cell; monodictyphenone; xanthone; XptB; AN2601; AN8434; AN8435; NptA; AN11080; MutA; RfeA; AN2943; fungal cells; developmental programs; Gerhard Braus; Benedict Dirnberger; AgnB; XptC; XptA; Hülle cell; Subtending Hyphae; Globose-thick walled cell; Fruiting bodies; Secondary metabolism; Oliver Valerius; Stefanie pöggeler

German

Der homothallische Schimmelpilz Aspergillus nidulans produziert als Überwinterungsstrukturen geschlossene Fruchtkörper, welche man als Cleistothecien bezeichnet. Diese enthalten als Produkt der Meiose Ascosporen. Die Entwicklung der Fruchtkörper ist mit einem spezifischen sekundären Stoffwechsel verbunden, der mit der Bildung einer Reihe von spezialisierten Zellen, wie den dickwandigen globosen mehrkernigen Hülle-Zellen, gekoppelt ist. Die Methyltransferase LaeA ist als epigenetischer Regulator von zahlreichen sekundären Metabolit-Gen-Clustern für die Bildung von Hülle-Zellen erforderlich. Das Aussetzen der Bildung von Hülle-Zellen führt zu einer signifikanten Reduktion der Größe der Cleistothecien, woraus auf eine das Wachstum des Fruchtkörpers fördernde Funktion der Hülle-Zellen geschlossen werden kann. In dieser Arbeit werden Proteome verschiedener Pilz-Zelltypen aus unterschiedlichen Entwicklungsprogrammen und aus angereicherten Fraktionen von Hülle-Zellen mit solchen verglichen, die aus Kolonien an der Oberfläche oder aus Flüssigmedien stammten. In einer quantitativen Proteom-Analyse wurden die Ergebnisse mit vegetativen Mycelien verglichen, denen die Methyltransferase LaeA fehlte. Das führte zu einer signifikanten Reduktion der Hülle-Zellen Bildung sowie des mit dem sexuellen Programm verbundenen Sekundärmetabolismus. Vergleichende Proteomik in Verbindung mit fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen zeigte, dass zum Beispiel die Prenyltransferase XptB und andere Proteine, kodiert aus den Monodictyphenon (mdp) / Xanthon (xpt) sekundären Metabolit-Gen-Clustern, in Hülle-Zellen aus Fest- beziehungweise Flüssigmedium sowie aus einem sexuellen Mycel gefunden werden. NptA repräsentiert die zweite Prenyltransferase und konnte in verschiedenen Pilz-Zelltypen sowie in Hülle-Zellen identifiziert werden. Durch quantitative Proteomik-Analysen wurde festgestellt, dass bei Fehlen von LaeA die Prenyltransferase NptA eine reduzierte Proteinmenge aufwies. Das gemeinsame überlappende (Core-) Proteom der identifizierten Proteine stimmt zu cirka 72% bei an der Oberfläche gewachsenen Hülle-Zellen und jenen, die aus Flüssigmedium stammten, überein. Neben den mdp/xpt Proteinen zeigte das gemeinsame überlappende (Core-) Proteom noch zwei weitere Proteine, das Ankyrin-Domäne-Protein (AN8434) und das Tryosin-Domäne-Protein (AN8435), die eine zelluläre Lokalisierung in Hülle-Zellen in fluoreszenzmikroskopischen Analysen aufweisen. Im Gegensatz zu Hülle-Zellen, welche aus Flüssigmedium stammen, zeigen Hülle-Zellen, welche aus Oberflächen-Kulturen herrühren, eine erhöhte Protein-Anzahl an Glukanasen auf. Ein weiteres spezifisches Protein, das putative Maltose-Transport Protein MphA (Maltose Permease-artiges Protein von Hülle-Zellen) wurde ausschließlich in Hülle-Zellen aus Festmedium und nicht aus Flüssigmedium identifiziert. Genetische Studien zur Deletion von MphA zeigten, dass das MphA Protein, angereichert in Oberflächen-Hülle-Zellen, das Wachstum sowie die asexuelle und die sexuelle Entwicklung des Pilzes unterstützt.
 
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