Zur Kurzanzeige

Beta-Peptide Helices As Transmembrane Domains: Aggregation, Recognition and Lipid-Peptide Interaction

dc.contributor.advisorDiederichsen, Ulf Prof. Dr.
dc.contributor.authorBanerjee, Amartya
dc.date.accessioned2019-01-25T09:58:47Z
dc.date.available2019-01-25T09:58:47Z
dc.date.issued2019-01-25
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-002E-E56E-5
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-7238
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-7238
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-7238
dc.description.abstractপ্লাজমা ঝিল্লি একটি প্রাথমিক কার্যকরী ইউনিট হিসাবে একটি কোষ দক্ষ কার্যকরী জন্য অপরিহার্য হিসাবে গণ্য করা হয়। এই ঝিল্লিগুলি বহিরাগত কোষের কোষের ভিতরের অংশটিকে পৃথক করে এবং পাশাপাশি এটি জুড়ে চলমান নিয়ন্ত্রনের বাধা হিসাবে কাজ করে। প্লাজমা ঝিল্লিগুলি বিভিন্ন বিভিন্ন উপাদানের সাথে গঠিত, তবে সবার মধ্যে, ঝিল্লি প্রোটিনগুলিকে বৈজ্ঞানিক সম্প্রদায়ের দ্বারা প্লাজমা ঝিল্লির প্রধান কাঠামোগত এবং কার্যকরী স্তম্ভগুলির মধ্যে সর্বসম্মতিক্রমে গ্রহণ করা হয়। বৈজ্ঞানিক গবেষণায়, ঝিল্লী প্রোটিনগুলির কার্যকারিতা গুরুতর রোগের জন্য দায়ী বলে মনে করা হয়েছে। সুতরাং, এটি কৃত্রিম ট্রান্সমেম্রেন প্রোটিন ডোমেনগুলি ডিজাইন এবং বিকাশের জন্য একটি দুর্দান্ত বৈজ্ঞানিক আগ্রহ রয়েছে যা স্বাভাবিকের ত্রুটিগুলির সমাধান করতে সক্ষম। এই প্রোটিন ডোমেনগুলির ভাঁজ গঠন এবং ট্রান্সমেমব্রেন গতিবিদ্যা পিছনে আণবিক শক্তি এবং অন্যান্য পদার্থ-রাসায়নিক প্রক্রিয়াগুলি বোঝা হালনাগাদকৃত কৃত্রিম ট্রান্সমিম্ব্রেন প্রোটিন ডোমেনগুলি বিকাশের প্রক্রিয়ার অবিচ্ছেদ্য অংশ। গত দুই দশক ধরে, বিটা-পেপটাইডগুলি আরও প্রতিশ্রুতিশীল পেপটিডোমিম্যাটিক মোটিফগুলির মধ্যে একটি হিসাবে বিবর্তন হয়েছে। প্রোটিলাইটিক হ্রাসের বিরুদ্ধে অসাধারণ স্থিতিশীলতা এবং স্থিতিশীল হেলিকাল সেকেন্ডারি স্ট্রাকচার যেমন 14 -12- এবং বিকল্প 10 / 1২-হেলিসেসগুলি 4-6 এমিনো এসিডগুলি তৈরি করার ক্ষমতা, এর পিছনে দুটি প্রধান কারণ peptidomimetics মধ্যে β-peptides এর বিমোচন এন্ট্রি। অন্যান্য গুরুত্বপূর্ণ প্যারামিটারগুলির পাশাপাশি পেপটাইডের হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তটি ট্রান্সমেম্রেন সন্নিবেশ এবং বিস্তারের ক্ষেত্রে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা বলে মনে করা হয়। পেপটাইডগুলির হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের সরাসরি পরীক্ষামূলক সিদ্ধান্ত অত্যন্ত চ্যালেঞ্জিং হচ্ছে, হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের সম্ভাব্য প্রভাবগুলি কেবলমাত্র তাত্ত্বিকভাবে প্রস্তাবিত। অতএব, এই থিসিসের প্রধান উদ্দেশ্যগুলি ট্রান্সমেম্রেন সন্নিবেশ এবং বিস্তারের পাশাপাশি পরোক্ষ পরীক্ষার মাধ্যমে সেলুলার উপসর্গের মধ্যে হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের সম্ভাব্য ভূমিকা পালন করা। সাধারণভাবে, β-peptides নির্দিষ্ট হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্ত থাকে তবে প্রাকৃতিকভাবে ঘটমান α-peptide analogues এর তুলনায় বিপরীত দিকে থাকে। ধারণাটি হল বিটা-পেপটাইডের একটি ধরণের সনাক্তকরণ এবং সংশ্লেষ করা যার প্রায় মোট কোনও হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্ত নেই এবং β-peptides সহ এবং হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল ছাড়া ট্রান্সমেমব্রেন সন্নিবেশ স্টাডিজগুলি অন্যান্য সমস্ত পরামিতিগুলিকে ধ্রুবক রাখে। ক্ষেত্রে, তারা ঝিল্লি সন্নিবেশের জন্য কোন ডিফারেনশিয়াল ক্ষমতা প্রদর্শন করে, এটি পরীক্ষামূলকভাবে নিজ নিজ পদার্থ-রাসায়নিক ঘটনায় হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোলের ভূমিকা নির্দেশ করবে। ব্যাপক গবেষণার পরে, বিকল্প β3 / β2-amino অ্যাসিডের সংযোজিত বিকল্প 10/12-হেলিকাল β-peptides তাদের অনন্য রূপান্তরিত অভিযোজন কারণে সামগ্রিক অলঙ্কৃত হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল পাওয়া যায় নি। অতএব, বিভিন্ন ধরণের β-peptides সহ 14-, 12- এবং বিকল্প 10/12-হেলিক্যাল পেপটাইড তুলনীয় ট্রান্সমেম্রেন দৈর্ঘ্য এবং ক্রম সহ বিভিন্ন সিন্থেটিক কৌশল মিশ্রিত করে সংশ্লেষিত করার পরিকল্পনা করা হয়েছে, যেমন মাইক্রোওয়েভ সহায়তায় ম্যানুয়াল SPPS, অ- মাইক্রোওয়েভ সহায়তায় ম্যানুয়াল SPPS, এবং ফ্লুরোস-ট্যাগ সংযুক্ত তরল ফেজ পেপটাইড সংশ্লেষণ। পরের ধাপে, পেপাইডাইডগুলির ট্রান্সমেমব্রেন সন্নিবেশ হাইড্রোফোবিক মাইক্রো-এনভায়রনমেন্ট সংবেদনশীল ট্রপ-ফ্লোরেসেন্স স্পেকট্রোস্কপি দ্বারা পরীক্ষা করা হবে। তিনটি ভিন্ন লিপিড, ডিএলপিসি / ডিএমপিসি / পিওপিসি এর একই গোষ্ঠীটি বিভিন্ন 14-, 12-এবং বিকল্প 10/12-হেলিক্যাল পেপাইডাইডের জন্য তুলনামূলক দৈর্ঘ্যের সাথে এইভাবে নির্বাচিত হয় যে নেতিবাচক হাইড্রোফোবিক মেলেম্যাচ ধীরে ধীরে একটি প্রায় পুরোপুরি hydrophobic ম্যাচিং পরিস্থিতি। এটি ভালভাবে জানা গেছে যে নেতিবাচক হাইড্রোফোবিক মেলেম্যাচের থ্রেশহোল্ড মানের উপরে ট্রান্সমেমব্রেন সন্নিবেশ সম্ভব নয়। অন্য দিকে, ইথানল মত শর্ট চেইন অ্যালকোহল, অ্যাসিড চেইন interdigitating দ্বারা লিপিড ঝিল্লি বেধ কমানোর একটি উচ্চারণ প্রভাব ভোগ করতে পরিচিত। অতএব, ETOH এর ক্রমবর্ধমান বৃদ্ধি ঘনত্বটি বিভিন্ন পেপটাইডের জন্য ব্যবহার করা হবে এবং একই লিপিডের জন্য একই পেপাইডাইডগুলির জন্য প্রতিটি পেপাইডাইডের জন্য প্রয়োজনীয় ন্যূনতম থ্রেশহোল্ড ঘনত্বের অনুরূপ নেতিবাচক হাইড্রোফোবিক মেলেম্যাচটি সাবধানে ন্যূনতম ক্ষতিপূরণ নেতিবাচক ক্ষতিপূরণ হিসাবে পর্যবেক্ষণ করা হবে। Trp-fluorescence বর্ণালী ক্রিয়ার সাহায্যে সফল ট্রান্সমেমব্রেন সন্নিবেশের জন্য অপরিসীম প্রয়োজন। এই পরীক্ষামূলক ফলাফল থেকে, এই সিদ্ধান্তে পৌঁছানো সম্ভব হবে যে পেপাইডাইডটি ETOH- এর আরো কম ঘনত্বের প্রয়োজন, যা নেতিবাচক মেলামেশের উচ্চতর ক্ষতিপূরণ, লিপিড ঝিল্লিতে পুনর্গঠন করতে সফলভাবে, ট্রান্সমেম্রেন সন্নিবেশ এবং বিস্তারের দিকে কম প্রবণ। ক্ষেত্রে, হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের সাথে এবং পেপাইডাইডগুলি এই আচরণের প্রতি কোনও ডিফারেনশিয়াল প্রবণতা প্রদর্শন করে, এটি পরোক্ষভাবে নির্দেশ করে এবং পরীক্ষামূলকভাবে ট্রান্সমেম্রেন সন্নিবেশ এবং স্প্যানিংয়ের মধ্যে হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের উল্লেখযোগ্য ভূমিকা যাচাই করবে (যেহেতু পেপাইডাইডগুলির মধ্যে প্রধান পার্থক্য হল হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের উপস্থিতি এবং অনুপস্থিতি)। তাছাড়া, লিপিড পরিবেশের অভ্যন্তরে যখন চারিত্রিক হেলিক্যাল প্যাটার্নটি রক্ষণাবেক্ষণ করা হয় কিনা তা ব্যাখ্যা করার জন্য, বিভিন্ন পেপাইডাইডগুলির দ্বিতীয় হেলিক্যাল কাঠামো সমাধান এবং পাশাপাশি অভ্যন্তরীণ লিপিড ভিসিক্যালগুলিতে নির্ধারণ করা হবে। তাপমাত্রা নির্ভর সিডি-স্পেকট্রসকপি দ্বারা সমাধান হিসাবে তুলনায় লিপিড vesicles ভিতরে যখন 14- এবং 10/12-হেলিক্যাল পেপটাইড স্থিতিশীলতা পরিবর্তন করা হয় কিনা তা পরীক্ষা করা হবে। হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তটি সমাধান বা অভ্যন্তরীণ লিপিড vesicles মধ্যে সেকেন্ডারি হেলিকাল কাঠামো স্থিতিশীল করতে কোনো প্রভাব আছে কিনা তাও ইঙ্গিত করে। অবশেষে, 6-অ্যামিনো অ্যাসিড দীর্ঘ শৃঙ্খল চেইন 14-হেলিকাল এবং 10 / 1২-হেলিকাল 5 (6) -ফ্যাম সংযুক্ত পেপটাইডগুলি মানব ব্রোঞ্চিয়াল এডেনোকার্কিনোমা সেল লাইন A549 ব্যবহার করে সেলুলার আপটেক স্টাডিজের জন্য সংশ্লেষিত হয়। প্রথমটি ক্লোজোজেনিক অ্যাস এবং এমটিটি-অ্যাস দ্বারা একই কোষ লাইনে সাইটোটক্সিসটিটি পরীক্ষা করা হয়। যদি 1 μM ঘনত্ব না হওয়া পর্যন্ত অ-সাইটোটক্সিক পাওয়া যায়, তাহলে ফ্লোরোসেন্স অ্যাক্টিভেটেড সেল সোর্সিং (FACS) দ্বারা পরিমাণগত সেলুলার উত্তোলনের দক্ষতার দিকে আরও গবেষণা 14- এবং বিকল্প 10/12-হেলিক্যাল পেপাইডাইডগুলি হয়। একটি সুপরিচিত কোষ তীক্ষ্ণ পেপটাইড, এইচআইভি -1 ট্যাট, একটি রেফারেন্স মান হিসাবে ব্যবহৃত হয়। দুটি লক্ষ্য পেপটাইডগুলির মধ্যে সেলুলার আপটেক কার্যকারিতাগুলির মধ্যে কোন পার্থক্য পরীক্ষামূলকভাবে নির্দেশ করবে যে হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তটি ট্রান্সমেমব্রেন সন্নিবেশ এবং বিস্তারকে প্রভাবিত করে না তবে সেলুলার অ্যাকটেককেও নিয়ন্ত্রণ করে। FACS ফলাফলগুলি নিশ্চিত এবং সমর্থন করার জন্য, পেপাইডাইডগুলি কন confocal লেজার স্ক্যানিং ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কপি অধীনে দৃশ্যমান হবে। মাইক্রোস্কোপি ইমেজিং প্রদর্শন করবে যে টার্গেট পেপাইডগুলি প্রকৃতপক্ষে সেল অনুপ্রবেশের মাধ্যমে অভ্যন্তরীণ হয় কিনা বা শুধুমাত্র ঝিল্লিতে আটকা পড়ে। উপরন্তু, যদি কোন লক্ষ্য β-peptides উল্লেখযোগ্য কোষ অনুপ্রবেশ ক্ষমতা পাওয়া যায়, এটি নতুনত্ব, হাইড্রোফোবিক, uncharged সেল ভেতরে পেপটাইড (সিপিপি) প্রার্থী যারা proteases উপস্থিতি স্থিতিশীল স্থিতিশীল দিকে একটি নতুন বর্ণমালা খুলতে হবে। অবশেষে, এই সমস্ত গবেষণাগুলি পরীক্ষামূলকভাবে ট্রান্সমেম্রেন সন্নিবেশ, বিস্তার এবং সেলুলার উপসাগরীয় অঞ্চলে ঝিল্লি প্রোটিন ডোমেনের হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের নিয়ন্ত্রক প্রভাবের উপর আলোকপাত করবে। এই তথ্যটি এই গুরুত্বপূর্ণ পদার্থ-রাসায়নিক ঘটনাগুলিতে পেপটাইড হেলিক্যাল ম্যাক্রো-ডিপোল মুহূর্তের প্রভাবকে মোকাবেলা করবে এবং β-পেপটাইড ভিত্তিক মডেল ট্রান্সমেম্রেন ডোমেন সিস্টেমগুলি পাশাপাশি β-পেপটাইড-ভিত্তিক নতুন প্রজন্মের কোষ তীব্র পেপটাইডগুলি ডিজাইনে সহায়তা করবে।de
dc.language.isoengde
dc.publisherNiedersächsische Staats- und Universitätsbibliothek Göttingende
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subject.ddc540de
dc.titleBeta-Peptide Helices As Transmembrane Domains: Aggregation, Recognition and Lipid-Peptide Interactionde
dc.typedoctoralThesisde
dc.contributor.refereeDiederichsen, Ulf Prof. Dr.
dc.date.examination2018-09-21
dc.description.abstractgerPlasmamembranen gelten als primäre regulatorische Einheit, die für das effiziente Funktionieren einer Zelle unerlässlich ist. Diese Membranen trennen den inneren Teil der Zelle von der extrazellulären Welt und wirken als Barriere, die den Durchgang selektiv reguliert. Die Plasmamembranen bestehen aus verschiedenen Bestandteilen, aber unter allen werden Membranproteine ​​von der wissenschaftlichen Gemeinschaft einstimmig als eine der wichtigsten strukturellen und funktionellen Säulen der Plasmamembranen angesehen. Im Laufe der wissenschaftlichen Forschung wurde festgestellt, dass Fehlfunktionen der Membranproteine ​​für schwere Erkrankungen verantwortlich sind. Daher war es von großem wissenschaftlichen Interesse, künstliche Transmembranproteindomänen zu entwerfen und zu entwickeln, die die Unzulänglichkeiten der natürlichen überwinden können. Das Verständnis der molekularen Kräfte und anderer physikalisch-chemischer Prozesse, die der Faltungskonformation und der Transmembrandynamik dieser Proteindomänen zugrunde liegen, ist ein wesentlicher Bestandteil bei der Entwicklung aktualisierter synthetischer Transmembranproteindomänen. In den letzten zwei Jahrzehnten war die Entwicklung von β-Peptiden als eines der vielversprechenderen peptidomimetischen Motive im Gange. Die außergewöhnliche Stabilität gegen proteolytischen Abbau in Gegenwart von Proteasen und die Fähigkeit, stabile helikale Sekundärstrukturen wie 14-12- und alternierende 10/12-Helices mit nur 4-6 Aminosäuren zu erzeugen, sind die beiden Hauptgründe boomender Eintritt von β-Peptiden in Peptidomimetika. Man nimmt an, dass neben allen anderen wichtigen Parametern das helikale Makro-Dipol-Moment der Peptide eine bedeutende Rolle bei der Insertion und dem Spanning von Transmembranen spielt. Da die direkte experimentelle Bestimmung des helikalen Makropipolmoments von Peptiden äußerst schwierig ist, wurden die möglichen Auswirkungen des helikalen Makropipolmoments nur theoretisch vorgeschlagen. Daher ist es eines der Hauptziele dieser Arbeit, die mögliche Rolle des helicalen Makropipolmoments bei der Insertion und Überspannung von Transmembran sowie bei der Aufnahme von Zellen durch indirekte Experimente zu beleuchten. Im Allgemeinen besitzen β-Peptide ein bestimmtes helikales Makropipolmoment, jedoch in entgegengesetzter Richtung im Vergleich zu den natürlich vorkommenden α-Peptidanaloga. Die Idee ist, einen Typ von β-Peptid zu lokalisieren und zu synthetisieren, der fast kein gesamtes helikales Makropipolmoment aufweist, und Transmembran-Insertionsstudien mit den β-Peptiden mit und ohne helikalem Makropipol durchzuführen, wobei alle anderen Parameter konstant gehalten werden. Falls sie eine unterschiedliche Fähigkeit zur Membraninsertion aufweisen, würde dies experimentell die Rolle des helikalen Makropipols in dem jeweiligen physikalisch-chemischen Phänomen anzeigen. Nach umfangreichen Forschungen wurde festgestellt, dass alternative 10/12-helikale β-Peptide, die aus alternativen β3 / β2-Aminosäuren bestehen, aufgrund ihrer einzigartigen Konformationsausrichtung insgesamt einen null-neutralisierten helikalen Makro-Dipol aufweisen. Daher sollen verschiedene Arten von β-Peptiden, einschließlich 14-, 12- und alternativer 10/12-helikaler Peptide mit vergleichbarer Transmembranlänge und -sequenz, durch Mischen verschiedener Synthesestrategien synthetisiert werden, z. B. mikrowellenunterstütztes manuelles SPPS, nicht- mikrowellenunterstütztes manuelles SPPS und Flüssigphasen-Peptidsynthese. Als nächster Schritt wird die Transmembraninsertion der Peptide durch hydrophobe, auf die Mikroumgebung empfindliche Trp-Fluoreszenzspektroskopie überprüft. Dieselbe Gruppe von drei verschiedenen Lipiden, DLPC / DMPC / POPC, wird für alle verschiedenen 14-, 12- und alternierenden 10/12-helikalen Peptide mit vergleichbarer Länge so gewählt, dass ausgehend von ein langsames, hydrophobes Mismatch induziert wird fast perfekt hydrophobe Anpassungssituation. Es ist bekannt, dass die Transmembran-Insertion oberhalb eines Schwellenwerts einer negativen hydrophoben Fehlpaarung nicht durchführbar ist. Auf der anderen Seite ist bekannt, dass kurzkettige Alkohole wie Ethanol eine ausgeprägte Wirkung bei der Verringerung der Lipidmembrandicke besitzen, indem sie die Acylketten interdigitieren. Daher würde eine allmählich erhöhte Konzentration von EtOH für die verschiedenen Peptide verwendet werden, und die für jedes Peptid für das gleiche Lipid mit einer ähnlichen negativen hydrophoben Fehlpaarung erforderliche Mindestschwellwertkonzentration von EtOH würde sorgfältig überwacht werden, um eine quantitative Abschätzung der Minimalkompensation des Negativen zu erhalten Fehlpaarung für eine erfolgreiche Transmembraninsertion mit Hilfe der Trp-Fluoreszenzspektroskopie erforderlich. Aus diesen experimentellen Ergebnissen könnte man schließen, dass das Peptid, das eine höhere Mindestkonzentration an EtOH erfordert, das heißt eine höhere Kompensation der negativen Fehlpaarung, um erfolgreich in Lipidmembranen rekonstituiert zu werden, weniger zur Insertion und zum Überspannen von Transmembranen neigt. Falls die Peptide mit und ohne helikales Makro-Dipol-Moment eine unterschiedliche Neigung zu diesem Verhalten zeigen, würde dies indirekt die bedeutende Rolle des helikalen Makro-Dipol-Moments bei der Insertion und beim Überspannen von Transmembranen anzeigen und experimentell verifizieren (da der Hauptunterschied zwischen den Peptiden besteht) das Vorhandensein und Fehlen eines helicalen Makropipolmoments). Darüber hinaus würden die sekundären helikalen Strukturen aller verschiedenen Peptide sowohl in Lösung als auch in den Lipidvesikeln innerhalb der Lipide bestimmt, um zu klären, ob das charakteristische helikale Muster in der Lipidumgebung erhalten bleibt. Es würde auch geprüft, ob sich die Stabilität von 14- und 10/12-helikalen Peptiden im Inneren von Lipidvesikeln im Vergleich zu in Lösung durch temperaturabhängige CD-Spektroskopie verändert. Dies würde auch anzeigen, ob das helikale Makropipolmoment eine Wirkung bei der Stabilisierung der sekundären helikalen Strukturen in Lösung oder in Lipidvesikeln hat. Schließlich werden 6 Aminosäuren lange, kurzkettige 14-helikale und 10/12-helikale 5 (6) -FAM-gebundene Peptide für zelluläre Aufnahmestudien unter Verwendung von humanen bronchialen Adenokarzinom-Zelllinien A549 synthetisiert. Zunächst wird die Zytotoxizität auf derselben Zelllinie durch klonogenen Assay und MTT-Assay überprüft. Wenn festgestellt wird, dass es bis zu einer Konzentration von 1 μM nicht zytotoxisch ist, werden weitere Studien zur quantitativen zellulären Aufnahmeeffizienz durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) an 14- und alternierenden 10/12-helikalen Peptiden durchgeführt. Ein bekanntes zellpenetrierendes Peptid, HIV-1 TAT, wird als Referenzstandard verwendet. Jeder Unterschied in der Effizienz der zellulären Aufnahme zwischen den beiden Zielpeptiden würde experimentell darauf hinweisen, dass das helikale Makro-Dipol-Moment nicht nur die Insertion und Spanning von Transmembran beeinflusst, sondern auch die zelluläre Aufnahme reguliert. Um die FACS-Ergebnisse sicherzustellen und zu unterstützen, würden die Peptide auch unter konfokaler Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Die mikroskopische Abbildung würde zeigen, ob die Zielpeptide tatsächlich durch Zellpenetration internalisiert werden oder nur an den Membranen haften. Wenn sich herausstellt, dass eines der Ziel-β-Peptide eine signifikante Zellpenetrationsfähigkeit aufweist, würde dies ein neues Spektrum für die Entwicklung neuer, hydrophober, ungeladener, durch Zellpenetrationspeptide (CPP) geeigneter Kandidaten eröffnen, die in Gegenwart von Proteasen stabil sind. Schließlich würden all diese Studien experimentell Aufschluss über den regulatorischen Effekt des helicalen Makropipolmoments von Membranproteindomänen bei der Transmembraninsertion, -spanne und -aufnahme geben. Diese Informationen würden sich auf den Effekt des helixen Peptidmakro-Dipol-Moments in diesen wichtigen physikalisch-chemischen Phänomenen beziehen und beim Entwurf von auf β-Peptid basierenden Modell-Transmembrandomänensystemen sowie auf auf Peptid basierenden Peptiden der neuen Generation von Zellen helfen.de
dc.description.abstractengPlasma membranes are considered as the primary regulatory unit essential for efficient functioning of a cell. These membranes separate the inner part of the cell from the extracellular world as well as acts as a barrier selectively regulating the passage across it. The plasma membranes are composed of various different constituents, but among all, membrane proteins are unanimously accepted as one of the major structural and functional pillars of the plasma membranes by the scientific community. In course of scientific research, malfunctioning of the membrane proteins have been found to be responsible for serious diseases. So, it has been of great scientific interest to design and develop artificial transmembrane protein domains that are able to address the shortcomings of the natural ones. Understanding the molecular forces and other physico-chemical processes behind the folding conformation and transmembrane dynamics of these protein domains are an integral part in the process of developing updated synthetic transmembrane protein domains. During last two decades, evolution of β-peptides as one of the more promising peptidomimetic motifs has been at large. The extraordinary stability against proteolytic degradation in presence of proteases and ability to generate stable helical secondary structures, such as, 14- 12- and alternate 10/12-helices, with as few as 4-6 amino acids are the two main reasons behind the booming entry of β-peptides into peptidomimetics. Besides all other important parameters, the helical macro-dipole moment of peptides is thought to have significant role in transmembrane insertion and spanning. Direct experimental determination of helical macro-dipole moment of peptides being extremely challenging, the possible effects of helical macro-dipole moment has only been theoretically proposed. Therefore, one of the major objectives of this thesis is to shed light on any possible role of helical macro-dipole moment in transmembrane insertion and spanning as well as in cellular uptake via indirect experiments. In general, β-peptides possess definite helical macro-dipole moment but in opposite direction as compared to that of the naturally occurring α-peptide analogues. The idea is to locate and synthesize a type of β-peptide that has almost no overall helical macro-dipole moment and perform transmembrane insertion studies with the β-peptides with and without helical macro-dipole keeping all other parameters constant. In case, they exhibit any differential ability for membrane insertion, it would experimentally indicate the role of helical macro-dipole in the respective physico-chemical phenomenon. After extensive research, alternate 10/12-helical β-peptides composed of alternate β3/β2-amino acids was found to have overall nullified helical macro-dipole due to their unique conformational orientation. Therefore, different types of β-peptides including 14-, 12- and alternate 10/12-helical peptides with comparable transmembrane length and sequence are planned to be synthesized by mixing different synthetic strategies, such as, microwave-assisted manual SPPS, non-microwave-assisted manual SPPS, and fluorous-tag-attached liquid phase peptide synthesis. As the next step, transmembrane insertion of the peptides would be checked by hydrophobic micro-environment sensitive Trp-fluorescence spectroscopy. A same group of three different lipids, DLPC/DMPC/POPC, is chosen for all the different 14-, 12- and alternate 10/12-helical peptides with comparable lengths in such a way that negative hydrophobic mismatch is induced gradually starting from an almost perfectly hydrophobic matching situation. It is well known that above a threshold value of negative hydrophobic mismatch, transmembrane insertion is not feasible. On the other hand, short-chain alcohols, like ethanol, is known to possess a pronounced effect in reducing the lipid membrane thickness by interdigitating the acyl chains. Therefore, a gradual increased concentration of EtOH would be used for the different peptides and the minimum threshold concentration of EtOH required for each peptides for the same lipid with similar negative hydrophobic mismatch would carefully be monitored to have a quantitative estimation on the minimum compensation of negative mismatch required for successful transmembrane insertion with the help of Trp-fluorescence spectroscopy. From this experimental results, it would be possible to conclude that the peptide that requires more minimum concentration of EtOH, that is, higher compensation of negative mismatch, to successfully get reconstituted into lipid membranes, are less prone towards transmembrane insertion and spanning. In case, the peptides with and without helical macro-dipole moment exhibit any differential propensity towards this behavior, it would indirectly indicate and experimentally verify significant role of helical macro-dipole moment in transmembrane insertion and spanning (since the main difference between the peptides is the presence and absence of helical macro-dipole moment). Moreover, the secondary helical structures of all the different peptides would be determined in solution as well as inside lipid vesicles to elucidate whether the characteristic helical pattern is maintained when inside lipid environment. It would also be checked whether the stability of 14- and 10/12-helical peptides is altered when inside lipid vesicles in comparison to that in solution by temperature dependent CD-spectroscopy. This would also indicate if the helical macro-dipole moment has any effect in stabilizing the secondary helical structures in solution or inside lipid vesicles. Finally, 6-amino acid long short chain 14-helical and 10/12-helical 5(6)-FAM attached peptides are synthesized for cellular uptake studies using human bronchial adenocarcinoma cell lines A549. First the cytotoxicity is checked on the same cell line by clonogenic assay and MTT-assay. If found non-cytotoxic until 1 µM concentration, further studies towards quantitative cellular uptake efficiencies by fluorescence activated cell sorting (FACS) is carried out on 14- and alternate 10/12-helical peptides. A well-reputed cell penetrating peptide, HIV-1 TAT, is used as a reference standard. Any difference in cellular uptake efficiencies between the two target peptides would experimentally indicate that the helical macro-dipole moment not only affects transmembrane insertion and spanning but also regulates cellular uptake. To ensure and support the FACS results, the peptides would also be visualized under confocal laser scanning fluorescence microscopy. The microscopy imaging would exhibit whether the target peptides indeed are internalized via cell penetration or are only stuck to the membranes. Additionally, if any of the target β-peptides were found to have significant cell penetration potency, it would open a new spectrum towards developing novel, hydrophobic, uncharged cell penetrating peptide (CPP) candidates that are stable in presence of proteases. Finally, all these studies would experimentally shed light on the regulatory effect of the helical macro-dipole moment of membrane protein domains in transmembrane insertion, spanning and in cellular uptake. This information would address the effect of peptide helical macro-dipole moment in these important physico-chemical phenomena and help in designing β-peptide based model transmembrane domain systems as well as β-peptide-based new generation cell penetrating peptides.de
dc.contributor.coRefereeSteinem, Claudia Prof. Dr.
dc.subject.engTransmembrane Beta peptidesde
dc.subject.engHelical Macro Dipole Moemntde
dc.subject.engBeta2/Beta3 Transmembrane Peptide Helicesde
dc.subject.engHelical Secondary Structuresde
dc.subject.engMembrane Insertion Study by Intrinsic Trp-Fluoresencede
dc.subject.engCompensation of Negative Hydrophobic Mismatch by Adding Minimum volume of EtOHde
dc.subject.engFACS Studyde
dc.subject.engConfocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy Imagingde
dc.subject.engCytotoxicity Assayde
dc.subject.engEffect of Macro-Dipole Moment on Membrane Insertionde
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-002E-E56E-5-6
dc.affiliation.instituteFakultät für Chemiede
dc.subject.gokfullChemie  (PPN62138352X)de
dc.identifier.ppn1047415577


Dateien

Thumbnail

Das Dokument erscheint in:

Zur Kurzanzeige