Extending Resolution in All Directions: Image Scanning Microscopy and Metal-induced Energy Transfer

by Sebastian Isbaner
Doctoral thesis
Date of Examination:2019-02-13
Date of issue:2019-03-18
Advisor:Prof. Dr. Jörg Enderlein
Referee:Prof. Dr. Jörg Enderlein
Referee:Prof. Dr. Helmut Grubmüller
Referee:Prof. Dr. Andreas Janshoff
Referee:Prof. Dr. Alexander Egner
Referee:Prof. Dr. Fred Wouters
Referee:Dr. Sarah Adio
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-7287

 

 

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Description:thesis

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Abstract

English

Fluorescence microscopy is a powerful tool in the life sciences and is used to study structure and function on length scales from cells down to single molecules. In recent years, fluorescence microscopy has seen enormous improvements on the sensitivity to detect single molecules and on the resolution to look at ever smaller details. However, the resolution of an optical microscope is fundamentally limited by the diffraction limit of light. This limit can be bypassed using superresolution methods, but they often come with a trade-off against the complexity of the method which limits its wide application. In this thesis, we present three techniques that each improve the resolution of fluorescence microscopy: First, we increased the lateral resolution and the contrast of a confocal spinning disk microscope with image scanning microscopy. We developed a software package that controls the image acquisition and performs the image reconstruction. This allows to upgrade confocal spinning disk systems with a superresolution option without changing the optical path of the microscope. Second, we used metal-induced energy transfer to increase the axial resolution. We localized single emitters on DNA origami nanostructures with a precision of 5nm along the optical axis and demonstrated colocalization of up to three emitters. This method allows exceptional axial resolution within a range of 100nm for microscopes which are able to measure fluorescence lifetimes. Third, we developed an algorithm to correct dead-time artifacts in fluorescence lifetime imaging. This enabled us to accurately measure fluorescence lifetimes at high count rates which allows to increase the frame rate and thereby the time resolution of fluorescence lifetime imaging. All our methods extend the resolution in a different direction and thereby expand the capabilities of fluorescence microscopy.
Keywords: Fluorescence Microscopy; Fluorescence Lifetime Imaging; Superresolution Microscopy; Single Molecule Spectroscopy; Image Scanning Microscopy; Metal-induced Energy Transfer

German

Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine bedeutende Methode in den Lebenswissenschaften zur Erforschung von Struktur und Funktion auf Längenskalen von Zellen bis hin zu einzelnen Molekülen. In den letzten Jahren hat die Fluoreszenzmikroskopie enorme Verbesserungen hinsichtlich der Empfindlichkeit der Detektion einzelner Moleküle und der Auflösung immer kleinerer Strukturen erfahren. Die Auflösung eines optischen Systems ist jedoch grundsätzlich durch das Beugungslimit des verwendeten Lichts begrenzt. Dieses kann zwar mit hochauflösenden Methoden umgangen werden, die gesteigerte Auflösung geht allerdings oft auf Kosten erhöhter methodischer Komplexität, was ihre breite Anwendung beschränkt. In dieser Arbeit stellen wir drei Methoden vor, die eine Verbesserung der Auflösung eines Fluoreszenzmikroskops bieten: Im ersten Teil haben wir die laterale Auflösung und den Kontrast eines konfokalen Spinning-Disk- Mikroskops mithilfe des Image-Scanning-Microscopy-Verfahrens erhöht. Wir haben ein Softwarepaket entwickelt, das die Bilderfassung steuert und die Bildrekonstruktion durchführt. Dadurch können Spinning- Disk-Mikroskope zu hochauflösenden Mikroskopen aufgerüstet werden, ohne dass der Strahlengang des Mikroskops verändert werden muss. Im zweiten Teil haben uns wir das Phänomen des metallinduzierten Energietransfers zunutze gemacht, um die axiale Auflösung zu erhöhen. Wir haben damit einzelne Emitter auf DNAOrigami- Nanostrukturen mit einer Genauigkeit von 5nm auf der optischen Achse lokalisiert und die Kolokalisation von bis zu drei Emittern gezeigt. Dieses Verfahren ermöglicht Fluoreszenzlebensdauer- Mikroskopen eine herausragende axiale Auflösung innerhalb eines Bereichs von etwa 100 nm. Im dritten Teil haben wir einen Algorithmus entwickelt, um Totzeit-Artefakte in der Fluoreszenzlebensdauer- Mikroskopie zu korrigieren. Wir haben damit genaue Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bei hohen Zählraten durchführen können, was es erlaubt, die Bildfrequenz und damit die Zeitauflösung der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie zu erhöhen. Alle unsere Methoden erhöhen die Auflösung in eine andere Richtung und erweitern dadurch das Anwendungsspektrum der Fluoreszenzmikroskopie.
 
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