Insertion of an intrinsically disordered domain in VelB supports selective heterodimer formation of fungal velvet domain regulatory proteins in Aspergillus nidulans

by Sabine Thieme
Doctoral thesis
Date of Examination:2018-04-12
Date of issue:2019-04-10
Advisor:Prof. Dr. Gerhard H. Braus
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
Referee:Prof. Dr. Stefanie Pöggeler
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-7389

 

 

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Abstract

English

The fungal specific velvet domain mediates DNA-binding and protein-protein interaction and is structurally similar to the Rel homology domain of the mammalian immune and infection response NF-ᴋB regulator. Homo- and heterodimers of the four Aspergillus velvet domain proteins VeA, VelB, VelC and VosA control together with methyltransferases as LaeA the expression of developmental and secondary metabolite cluster genes in response to environmental stimuli, such as light or oxygen supply. Only VelB possesses a velvet domain, which is interrupted by an intrinsically disordered domain (IDD). The VelB IDD of Aspergillus nidulans consists of 99 amino acids. The location of this interruption of VelB is conserved in ascomycetes or basidiomycetes with considerable differences in lengths and amino acid sequences. Disordered domains can play central roles as hubs in protein interaction networks. This study focuses on VelB IDD function in the regulation of A. nidulans development and secondary metabolism. Deletion of fbox18, encoding a specific F-box protein, resulted in an increased cellular amount of VelB compared to wildtype. F box proteins are the substrate receptors of E3 SCF ubiquitin ligases. The VelB IDD also destabilizes the VelB protein and is therefore a possible target for ubiquitin mediated degradation by the 26S proteasome. VelB can form a homodimer as well as VelB-VeA or VelB-VosA heterodimers. VosA can form an additional VosA-VelC heterodimer. The molecular mechanisms how the fungal cell controls the appropriate ratios of homo- or heterodimers of the available velvet domain proteins are yet elusive. VelB VeA and heterotrimeric VelB-VeA-LaeA formation are independent of the presence or absence of the VelB IDD. Construction of a VelB without IDD revealed that VelB homodimer as well as VelB VosA heterodimer formation require the IDD of VelB. When only VosA-VosA can be formed and the interaction of VosA with VelB as well as VelC is impaired, the conidiation of the corresponding velBIDD∆/velC∆ mutant strain is delayed, and increased sterigmatocystin biosynthesis suggests an altered secondary metabolite production. The VelB IDD is required for efficient conidiation and control of secondary metabolism, because VelB without IDD resulted in changes in asexual development and secondary metabolite production. The corresponding velBIDD deletion mutant strain produced increased aerial hyphae but reduced numbers of conidiospores. Furthermore, it synthesized increased amounts of the mycotoxin sterigmatocystin but decreased levels of austinol and dehydroaustinol compared to wildtype. The results demonstrate that the fungal VelB intrinsically disordered domain is required to allow formation of distinct VelB homo- and heterodimers. This suggests a molecular mechanism where masking or demasking of the IDD could control the ratio of velvet domain protein complexes in response to different environmental stimuli. IDD interacting proteins or IDD posttranslational modifications could change cellular velvet complex ratios and support the appropriate fungal developmental program and secondary metabolism.
Keywords: velvet; VelB; Aspergillus nidulans; heterodimer formation; development; secondary metabolism; intrinsically disordered domain

German

Die Velvet-Domäne stellt ein DNA-Bindemotif und eine Protein-Protein-Interaktionsdomäne dar, welche strukturelle Gemeinsamkeiten zu der Rel-Homolgie-Domäne von NF-ᴋB, einem Regulator der Immun- und Infektionsreaktion in Säugetieren, besitzt. Homo- und Heterodimere der vier Aspergillus Velvet-Domänen-Proteine VeA, VelB, VelC und VosA kontrollieren zusammen mit Methyltransferasen wie LaeA die Expression entwicklungsspezifischer Gene und Sekundärmetabolit-Gencluster als Antwort auf Umweltreize, wie zum Beispiel Licht und die Verfügbarkeit von Sauerstoff. Nur VelB besitzt eine Velvet-Domäne, die von einer intrinsisch unstrukturierten Domäne (intrinsically disordered domain = IDD) unterbrochen ist. Die VelB IDD von Aspergillus nidulans besteht aus 99 Aminosäuren. Die Position dieser Unterbrechung von VelB ist konserviert in Ascomycota und Basidiomycyota, variiert jedoch erheblich in ihrer Länge und der Sequenz der Aminosäuren. Ungeordnete Domänen spielen eine zentrale Rolle als Netzknoten in Protein-Interaktions-Netzwerken. Die vorliegende Studie konzentriert sich auf die Rolle der VelB IDD in der Regulation der Entwicklung und des Sekundärmetabolismus in A. nidulans. Die Deletion von fbox18, einem spezifischen F-box Protein, führte zu einer erhöhten zellulären Menge von VelB im Vergleich zum Wildtyp. F-box Proteine sind die Substratrezeptoren in E3 SCF Ubiquitin-Ligasen. Die VelB IDD führt auch zu der Destabilisierung des VelB Proteins und ist deswegen ein mögliches Ziel für den Ubiquitin vermittelten Abbau durch das 26S Proteasom. VelB kann Homodimere als auch VelB-VeA oder VelB-VosA Heterodimere bilden. VosA kann außerdem noch VosA-VelC Heterodimere formen. Der molekulare Mechanismus wie die Pilzzelle das Verhältnis der Homo- und Heterodimer der verfügbaren Velvet Proteine kontrolliert ist noch nicht bekannt. Die VelB VeA Komplexbildung und die Formation des heterotrimerischen Velvet-Komplexes VelB-VeA-LaeA sind unabhängig von dem Vorhandensein oder Fehlen der VelB IDD. Die Konstruktion von einem VelB ohne die IDD zeigte, dass sowohl die VelB Homodimer, als auch die VelB-VosA Heterodimer-Bildung die VelB IDD benötigen. Wenn nur VosA-VosA gebildet werden kann und die Interaktion von VosA mit VelB als auch mit VelC behindert ist, ist die Bildung der Konidiosporen in der entsprechenden velBIDD∆/velC∆ Mutante verzögert und die erhöhte Biosynthese von Sterigmatocystin weist auf einen veränderten Sekundärmetabolismus hin. Die VelB IDD wird für effiziente Konidiosporenbildung und die Kontrolle des Sekundärmetabolismus benötigt, da ein VelB ohne die IDD in veränderter asexueller Entwicklung und Sekundärmetabolismus resultierte. Die entsprechende velBIDD Deletionsmutante produzierte mehr Luftmyzel und weniger Konidiosporen und synthetisierte eine erhöhte Menge des Mykotoxins Sterigmatocystin und weniger Austinol und Dehydroaustinol im Vergleich zum Wildtyp. Diese Ergebnisse zeigen, dass die intrinsisch ungeordnete Domäne von VelB benötigt wird, um die Bildung bestimmter Homo- und Heterodimere zu ermöglichen. Das deutet darauf hin, dass ein molekularer Mechanismus existiert, indem die Maskierung und Demaskierung der IDD das Verhältnis der Velvet-Protein-Komplexe als Antwort auf verschiedene Umweltreize kontrollieren kann. IDD interagierende Proteine oder IDD posttranslationale Modifikationen können das zelluläre Velvet-Komplex-Verhältnis ändern und das angemessene Pilzentwicklungsprogramm und Sekundärmetabolismus fördern.
 
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