isoSTED microscopy for live cell imaging

by René Siegmund
Doctoral thesis
Date of Examination:2019-02-22
Date of issue:2019-05-08
Advisor:Prof. Dr. Alexander Egner
Referee:Prof. Dr. Alexander Egner
Referee:Prof. Dr. Tim Salditt
Referee:Prof. Dr. Sarah Köster
Referee:Prof. Dr. Stefan Jakobs
Referee:Prof. Dr. Thorsten Hohage
Referee:Dr. Florian Rehfeldt
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-7433

 

 

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Format:PDF
Description:Dissertation

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Abstract

English

Far-field fluorescence microscopy is a versatile tool for the non-invasive investigation of intracellular structures and thus for live cell imaging. This is a major advantage over other microscopy methods such as electron microscopy or atomic force microscopy. Since the advent of super-resolution techniques such as stimulated emission depletion (STED) microscopy, protein structures within cells can be imaged with in principle unlimited resolution. In order to retrieve the maximum of available information by a measurement, it is beneficial if the microscope exhibits an isotropic resolution in all spatial dimensions. This can be achieved by applying the STED principle in a 4Pi microscope, which is termed isoSTED microscopy. Until now, only oil-immersion objective lenses were used for this technology, which limited isoSTED microscopy to the examination of fixed samples. \\In this thesis, for the first time, we present an isoSTED microscope utilizing water-immersion objective lenses and demonstrate an isotropic resolution better than 56~nm. This resolution is measured on fluorescent beads and also confirmed on recordings of antibody labeled cells. In this context a problem of isoSTED microscopy utilizing water-immersion objective lenses becomes apparent. In extended sample regions signal from planes above and below the focal plane is also detected and deteriorates the image quality significantly. A method to specifically measure these out-of-focus signals is presented. This allows to correct the recorded data, which is demonstrated for live cell imaging. \\ Exemplary for the versatile usability of the here presented isoSTED microscope, the microtubule, vimentin and actin network in different cell lines is imaged with an isotropic resolution better than 60~nm. The actin network is measured in cells grown on a collagen-coated polyacrylamide gels. This mimics the elasticity of the extracellular matrix surrounding the cell in tissue and therefore demonstrates the feasibility of isoSTED microscopy under physiological conditions. Furthermore, isoSTED time lapse recordings reveal the reorganization of microtubule and actin networks.
Keywords: Super-resolution microscopy; STED microscopy; live cell imaging; microscopy

German

Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie ist ein wichtiges Werkzeug für die Erforschung lebender Zellen, da sie intrazelluläre Strukturen nicht-invasiv abbilden kann. Dies stellt einen großen Vorteil gegenüber anderen Mikroskopieverfahren wie Elektronen- oder Rasterkraftmikroskopie dar. Die Verwendung neuer, hochauflösender Mikro-skopietechniken wie der STED-Mikroskopie (engl. Stimulated Emission Depletion, Fluoreszenzlöschung durch stimulierte Emission) erlaubt es, Strukturen in Zellen mit theoretisch unbegrenzter Auflösung zu untersuchen. Um ein Maximum an verfügbaren Informationen aus einer Messung zu erhalten, ist es von Vorteil, wenn das Mikroskop eine isotrope Auflösung in allen Raumrichtungen aufweist. Dies kann durch die Anwendung des STED-Prinzips in einem 4Pi-Mikroskop erreicht werden. Bisher wurde diese sogenannte isoSTED-Mikroskopie nur unter Verwendung von Ölimmersionsobjektiven durchgeführt, was die Anwendung auf die Untersuchung fixierter Proben beschränkte.\\ In dieser Arbeit präsentieren wir zum ersten Mal ein isoSTED-Mikroskop, welches mit Wasserimmersionsobjektiven arbeitet, und zeigen, dass hiermit eine isotrope Auflösung besser als 56~nm erzielt werden kann. Diese Auflösung wurde an fluo-reszierenden Kügelchen bestimmt und anhand von Aufnahmen von mit Antikörperfärbung markierten Strukturen in Zellen verifiziert. Dabei zeigt sich ein Pro-blem der isoSTED-Mikroskopie bei Verwendung von Wasserimmersionsobjektiven. In ausgedehnten Regionen der Probe wird zusätzliches Signal aus Ebenen oberhalb und unterhalb der Fokalebene detektiert, wodurch sich die Bildqualität signifikant verschlechtert. Wir zeigen eine Methode diese ungewollten Signalanteile separat zu detektieren, wodurch die gemessenen Daten korrigiert werden können. Dies erhöht die Bildqualität signifikant, was anhand von Aufnahmen von Strukturen innerhalb lebender Zellen demonstriert wird. \\ Exemplarisch für die vielseitige Einsetzbarkeit des hier vorgestellten isoSTED-Mikro-skops werden Messungen des Mikrotubuli-, Vimentin- und Aktinnetzwerks in verschiedenen Zelllinien mit einer isotropen Auflösung besser als 60 nm gezeigt. Dass die isoSTED-Mikroskopie prinzipiell geeignet ist physiologische Proben zu untersuchen, wird durch Aufnahmen des Aktinnetzwerks von Zellen, die auf kollagenbeschichteten Polyacrylamidgelen gezüchtet wurden, demonstriert. Hierbei wird durch das Gel die Elastizität der extrazellulären Matrix, welche Zellen üblicherweise im Gewebe umgibt, nachgebildet. Darüber hinaus zeigen wiederholte isoSTED-Aufnahmen über einen längeren Zeitraum, wie sich das Mikrotubuli- und Aktinnetzwerk innerhalb von lebenden Zellen umstrukturiert.
 
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