Functional study of potential sHSPs in Arabidopsis and tomato under environmental stress.
Functional study of potential sHSPs in Arabidopsis and tomato under environmental stress.
by Mariela Raquel Escobar
Date of Examination:2019-03-26
Date of issue:2019-05-10
Advisor:Prof. Dr. Ivo Feussner
Referee:Prof. Dr. Andrea Polle
Referee:Dr. Till Ischebeck
Referee:Dr. Estela Marta Valle
Referee:Dr. Juan Pablo Ortiz
Referee:Dr. Norberto Daniel Iusem
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Name:190204_PhDThesis_Escobar.pdf
Size:5.87Mb
Format:PDF
Description:Ph.D. Thesis
Abstract
English
Small heat shock proteins (sHSPs) respond to many environmental stresses, stabilizing early unfolding protein intermediates and avoiding their irreversible aggregation. In plants, organellar sHSPs are a unique cellular feature. The primary structure of sHSPs includes an N-terminal sequence of variable sequence and length, a conserved domain known as the α-crystallin domain (ACD) and a non-conserved C-terminal sequence. The ACD represents the conserved characteristic present in all sHSPs, although there are other proteins that contain an ACD but are not sHSPs. sHSPs belong to a big superfamily, and the functional and physiological relevance of the different sHSPs remains largely unknown. The objective of this study was to understand the role of mitochondrial sHSPs in Arabidopsis thaliana and Solanum lycopersicum under environmental stresses and to characterize putative bidirectional promoters driving the expression of ACD proteins with head-to-head orientation. This work covers aspects from the genomic organization and function of sHSPs-M in Arabidopsis to the role of sHSPs-M in chilling stress of tomato fruit. To perform all the experiments, Arabidopsis and tomato mutants using artificial microRNA technology were generated and analyzed in their proteome, metabolome, and lipidome. In the first part of this work, the functional characterization of head-to-head oriented genes encoding ACD proteins and the correspondent intergenic regions was performed. Four different bidirectional promoters in the A. thaliana genome, including the one of At5g51440 that encodes a mitochondrial sHSP (sHSP23.5), were successfully identified and characterized. The data suggest that the bidirectional promoter contained in the pair At5g51430-At5g51440 is strongly heat induced in one direction but not in the other. The promoter of At1g06460-At1g06470 showed comparable high activity in both directions and thus has a great potential to be used in genetic engineering. The other two promoters showed greater strength in one side and can be considered as asymmetric bidirectional promoters. This functional study of the promoters revealed the biotechnological potential of them because they can be induced specifically in a certain condition (such as high temperature) in one or two directions when it is required. In the second part, functional characterization of the mitochondrial sHSPs under stress conditions and during A. thaliana development is presented. Three gene paralogues were found in Arabidopsis (At5g51440, At4g25200, and At1g52560), and artificial microRNA were used to generate knock-down mutants (single, double and triple amiR). The single and double amiRs (for sHSP23.5 and sHSP23.6) did not show evidently affected phenotype, probably because of functional compensation or redundancy of the mitochondrial sHSPs. On the other hand, the triple amiR23.5/23.6/26.5 mutants showed an altered phenotype in the vegetative and reproductive stages. They have reduced leaves areas, but not the number of epidermal cells per leaf, chlorotic leaves, shorter root, and reduced seed yield when compared to Col-0 plants. Plants of triple amiR were considerably small due to the alteration in the process of cell expansion but not in the cellular proliferation, which indicates a profound alteration in the plant developmental program. Proteomic analysis of the amiR mutants revealed significant upregulation of various metabolism-related proteins and alterations in the abundance of several proteins that are involved in translation and in the ribosome functioning and structure. Triple amiR mutant exhibited a higher number of proteins with differential abundance related to these processes compared to the other single and double amiR23.5/23.6 mutants. Such a wide change in ribosome-related proteins suggests a possible alteration in the proper ribosome function. The data exposed in this work provide evidence of the important roles that sHSPs-M may play, not only in the heat response but also in the plant development of Arabidopsis. Results demonstrate that functional compensation might be responsible for the phenotype in mutants lacking single sHSPs-M. However, the reduction of the three sHSPs-M caused a profound disruption in the mitochondria and ribosome functionality that severely affected the energy metabolism and the overall cell homeostasis, leading to alterations in the correct plant development. In the last part of this work, the functional consequences of the down-regulation of sHSP23.8 in tomato fruit were investigated and analyzed in their phenotype and in their susceptibility to chilling injury. Pre-chilled fruit of amiR23.8 mutant showed higher loss of water and increased ion leakage of pericarp tissue compared to WT fruit. The amiR23.8 fruit deterioration indicates that it is highly susceptible to cold stress and developed chilling injury symptoms. The lipidome of fruit after chilling of amiR23.8 showed altered amounts of glycerolipids, and the level of saturated lipids in amiR23.8 decreased, but not lower than the level in WT under normal conditions. The opposite was found in the relative percentage of unsaturated lipids, having amiR23.8 fruit significantly lower levels in normal conditions and after chilling. The results presented here indicate a differential degradation of extraplastidic and plastidic lipids in amiR23.8 fruit, and alterations in the remodeling of the lipidome after cold stress, which may lead to higher sensitivity to chilling injury. The results discussed here indicate that sHSP23.8 may play an important role in the protection mechanisms against chilling stress in tomato fruit.
Keywords: Arabidopsis thaliana; Solanum lycopersicum; chilling injury; heat stress; bidirectional promoter; small heat shock proteins; plant development; tomato fruit
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Las proteínas pequeñas de choque térmico (sHSP) responden a una amplia variedad de estreses ambientales, estabilizando proteínas parcialmente desplegadas y evitando su agregación irreversible, en forma independiente de ATP. En plantas, las sHSPs son especialmente diversas siendo las sHSPs de organelas una característica única de las plantas. La estructura primaria de las sHSP incluye una secuencia N-terminal no conservada de longitud variable, un dominio α-cristalino conservado (ACD) y una secuencia C-terminal corta no conservada. El dominio ACD representa una característica conservada presente en todas las sHSPs, sin embargo, no todas las proteínas que contienen un dominio ACD son sHSP. Las sHSPs pertenecen a una gran superfamilia, siendo su importancia funcional y fisiológica en gran parte desconocida.
El objetivo de este trabajo fue dilucidar el rol de sHSPs de localización mitocondrial (sHSPs-M) en Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum en situaciones de estrés ambiental, y caracterizar probables promotores bidireccionales que regulan la expresión de genes codificantes de proteínas con dominio ACD con orientación cabeza a cabeza en el genoma de Arabidopsis.
Este trabajo cubre aspectos desde la organización genómica y la función de sHSPs-M en Arabidopsis hasta el rol de las sHSPs-M en la respuesta al estrés por frío de frutos de tomate. Para ello, se generaron plantas mutantes de Arabidopsis y de tomate utilizando la tecnología de silenciamiento génico por micro ARNs artificiales. Las plantas mutantes fueron analizadas en su proteoma, metaboloma y lipidoma en distintas condiciones de estrés. A continuación, se presenta un resumen de los resultados obtenidos.
En la primera parte de este trabajo, se realizó la caracterización funcional de genes con orientación cabeza a cabeza en el genoma de Arabidopsis, que codifican para proteínas con ACD y las regiones intergénicas correspondientes. Se lograron identificar y caracterizar cuatro distintos promotores bidireccionales, entre ellos el promotor del gen At5g51440 que codifica una sHSP de localización mitocondrial (sHSP23.5). Los resultados obtenidos sugieren que el promotor bidireccional contenido en el par At5g51430-At5g51440 es fuertemente inducido por altas temperaturas en una dirección, pero no así en la dirección opuesta. El promotor contenido en el par At1g06460-At1g06470 mostró una actividad alta en ambas direcciones, teniendo por ello, un alto potencial de aplicación en ingeniería genética. Los dos promotores restantes mostraron mayor actividad en una dirección y, por lo tanto, pueden ser considerados como promotores bidireccionales asimétricos. El estudio funcional de los promotores seleccionados reveló el potencial biotecnológico de los mismos ya que pueden ser inducidos específicamente en una determinada condición (como altas temperaturas) en una o en ambas direcciones cuando sea necesario.
En la segunda parte, se presenta la caracterización funcional de sHSP mitocondriales en condiciones de estrés y durante el desarrollo de Arabidopsis. Se identificaron tres genes parálogos en el genoma de Arabidopsis (At5g51440, At4g25200, y At1g52560), y se diseñaron microARN artificiales específicos para la obtención de plantas mutantes por silenciamiento (amiR simple, doble y triple). Las plantas amiR simples y dobles (para sHSP23.5 y sHSP23.6) no mostraron un fenotipo evidentemente afectado, probablemente debido a la compensación o redundancia funcional de las sHSP mitocondriales. Por otro lado, las plantas triple mutante amiR23.5/23.6/26.5 muestran un fenotipo alterado en las etapas vegetativa y reproductiva. Estas plantas presentan hojas pequeñas, células epidérmicas con áreas reducidas, pero no reducción en el número de células epidérmicas por hoja. Además, exhiben hojas cloróticas, raíces cortas y menor producción de semillas en comparación con las plantas Col-0. Las plantas triple amiR son considerablemente pequeñas debido a una alteración en el proceso de expansión celular, pero no en la proliferación celular, lo que indica una profunda alteración en el programa de desarrollo de la planta. En el análisis proteómico de las mutantes amiR se observó un aumento significativo de proteínas implicadas en el metabolismo, y alteración en la abundancia de varias proteínas relacionadas con la traducción, y con el funcionamiento y la estructura de los ribosomas. La triple mutante exhibió un mayor número de proteínas con abundancia alterada involucradas en estos procesos en comparación con las mutantes simples y doble amiR23.5/23.6. Estos cambios tan amplios observados en proteínas relacionadas con el funcionamiento de los ribosomas sugieren una posible alteración en la función normal de los mismos.
Los resultados presentados en este trabajo proporcionan evidencias sobre el importante rol de las sHSPs-M no sólo en la respuesta a las altas temperaturas, sino también durante el desarrollo de la planta de Arabidopsis. Los resultados indican que una compensación funcional podría ser responsable del fenotipo observado en las plantas mutantes con niveles reducidos de cada sHSPs-M individual. Sin embargo, la reducción simultanea de las tres sHSPs-M causó una profunda alteración en la función normal de mitocondrias y ribosomas, afectando gravemente el metabolismo energético y la homeostasis celular, lo que llevó a alteraciones en el desarrollo correcto de la planta.
En la última parte de este trabajo, las consecuencias de la disminución de la proteína sHSP23.8 de localización mitocondrial en frutos de tomate fueron investigadas. Los frutos fueron analizados en su fenotipo y en la susceptibilidad al daño por frío. Los frutos de las plantas mutantes amiR23.8 que fueron conservados en frío mostraron mayor pérdida de agua y de electrolitos en el tejido pericárpico en comparación con frutos WT. El deterioro observado en los frutos amiR23.8 indica que estos frutos mutantes son mayormente susceptibles al estrés por frío desarrollando síntomas de daño por frío. El lipidoma de los frutos amiR23.8 frigoconservados mostró cantidades alteradas de glicerolípidos, y los niveles de lípidos saturados en amiR23.8 disminuyeron luego del tratamiento con frío, pero no por debajo de los niveles encontrados en frutos WT en condiciones normales. Lo opuesto se encontró en el porcentaje relativo de lípidos insaturados, con niveles significativamente más bajos de insaturaciones en frutos amiR23.8 en condiciones normales y después del enfriamiento. Los resultados presentados indican una degradación diferencial de lípidos extraplastídicos y plastídicos en frutos amiR23.8, y alteraciones en la remodelación del lipidoma luego del estrés por frío, lo que podría conducir a una mayor sensibilidad al daño por frío. Los resultados discutidos aquí indican que la proteína sHSP23.8 podría estar directamente involucrada en los mecanismos de protección contra el estrés por frío en frutos de tomate.