Specific ubiquitin-dependent protein degradation requires a trimeric CandA complex in Aspergillus nidulans

by Anna Maria Köhler
Doctoral thesis
Date of Examination:2018-05-28
Date of issue:2019-05-20
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Kai Tittmann
Referee:Dr. Achim Dickmanns
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-7448

 

 

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Abstract

English

E3 cullin-RING ubiquitin ligase complexes are activated by modification of their cullin scaffold protein with the ubiquitin-like modifier Nedd8. Deneddylases as the COP9 signalosome (CSN) or Den1/A interact and destabilize these complexes by cleaving the isopeptide bond between Nedd8 and cullin. Non-neddylated cullins can bind Cand1/A, which is the exchange factor for the substrate recognition subunits of the E3 RING ligases. Most eukaryotes possess a single Cand1 polypeptide. The mold Aspergillus nidulans and its relatives encountered a DNA rearrangement, which resulted in separate genes for two CandA polypeptides. CandA-N corresponds to N terminal Cand1, blocking the neddylation site and CandA-C inhibits the interaction to the adaptor and substrate recognition subunits and thereby corresponds to the C-terminal Cand1. The Nedd8 blocking and adaptor-receptor exchange features are conserved in all eukaryotes. A. nidulans CandA proteins are required for asexual conidia production, sexual fruiting body formation, coordinated secondary metabolism and E3 ligase activity. Double deletion strains of candA N/denA, candA-N/csnE and candA-C/csnE resulted in strains without the potential of cleistothecia formation and with reduced asexual development. A triple deletion strain of candA-N/C/csnE was additionally reduced in vegetative growth. These observations underline the importance of deneddylation and the exchange of substrate recognition subunits to allow E3 ligase activity towards a variety of substrates. The gene candA-C is located five open reading frames upstream of candA-N. This thesis shows that the CandA-C ortholog of the human pathogen A. fumigatus includes an additional fungal specific N-terminal 190 amino acid extension encoded by an extra exon, which is not present in human Cand1. This extension of A. fumigatus corresponds to A. nidulans CandA-C1 as a third CandA protein of 19 kDa encoded by a third candA gene 269 bp upstream of candA-C. The three fungal CandA-C1, CandA-C and CandA-N proteins form a trimeric complex mainly in the nucleus. This complex specifically interacts with CulA, supporting its neddylation but does not interact with other cellular cullins. A. fumigatus CanA is different and interacts with CulA as well as CulC E3 ligases. The Aspergillus specific CandA-C1 subunit has common but also distinct cellular functions in comparison to the other CandA proteins. This work shows that CandA-C1 of A. nidulans is required for vegetative growth, cleistothecia maturation including ascospore formation and activation of the ubiquitin labeling machinery. However, unlike the other CandA proteins, CandA-C1 does not affect the secondary metabolism of orcinol derivatives. A. fumigatus CanA N-terminal extension is as important for germination and vegetative growth as CandA-C1 in A. nidulans. These results make the Aspergillus- specific CandA/CanA subunit an interesting candidate for a drug-based approach to control fungal spreading in immunocompromised patients that are infected with e.g. A. fumigatus caused bronchopulmonary aspergillosis without affecting the human ubiquitin-proteasome system.
Keywords: Aspergillus nidulans; asexual development; sexual development; secondary metabolism; E3 ligase; COP9 signalosome; Nedd8; Cand1; Den1; CSN; Aspergillus fumigatus; 26S Proteasome

German

E3-Cullin-RING-Ubiquitin-Ligase-Komplexe werden durch die kovalente Modifikation ihres Grundgerüst-Proteins Cullin mit dem ubiquitin-ähnlichem Modifizierer Nedd8 aktiviert. Deneddylasen, wie das COP9 Signalosom (CSN) und DenA interagieren und destabilisieren diese Komplexe durch die Trennung der Isopeptidbinding zwischen Nedd8 and Cullin. Nicht-neddylierte Culline können Cand1/A binden, welches der Austauschfaktor für die Substrat-Erkennungsmodule der E3 RING Ligasen ist. Die meisten Eukaryoten besitzen ein einzelnes Cand1 Polypeptit. Veränderungen in der Gen Anordnung führten bei dem Schimmelpilz Aspergillus nidulans und seinen Verwandten zur Trennung des CandA Gens in zwei separate Gene, die für jeweils eine CandA Protein-Untereinheit kodieren. CandA-N entspricht dem N terminalen Cand1 und verdeckt die Neddylierungsstelle. CandA-C entspricht dem C terminalen Cand1 und inhibiert die Bindung der Substratadapter-Proteine. Die Blockierung der Nedd8-Bindestelle und der Substratadapter-Austausch sind in allen Eukaryoten konserviert. Die A. nidulans CandA Proteine werden für die asexuelle Konidiosporenbildung, die sexuelle Fruchtkörperentwicklung, für einen koordinierten Sekundärmetabolismus und für E3 Ligase-Aktivität benötigt. Doppeldeletionsmutanten von candA-N/denA, candA-N/csnE und candA-C/csnE können keine Kleistothecien bilden und zeigen eine reduzierte asexuelle Entwicklung. Eine Dreifachdeletion von candA-N/C/csnE zeigt zusätzlich ein eingeschränktes vegetatives Wachstum. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Deneddylierung und der Austausch der Substratadaptoren für die Variablilität von Substraten der E3 Ligasen von großer Bedeutung sind. Das Gen candA-C liegt fünf offene Leserahmen vor dem Gen candA N. Diese Dissertation zeigt, dass das CandA-C orthologe Protein in A. fumigatus eine zusätzliche pilzspezifische N-terminale Verlängerung von 190 Aminosäuren hat, welche in einem separaten Exon kodiert ist, aber im menschlichen Cand1 fehlt. In A. fumigatus entspricht diese Erweiterung dem CandA-C1 protein von A. nidulans. Dieses ist ein drittes CandA Protein von 19 kDa und wird von einem dritten candA Gen kodiert, welches 269 bp vor dem candA-C Gen liegt. Die drei CandA-C1, CandA-C und CandA-N Proteine bilden einen Dreierkomplex der hauptsächlich im Zellkern zu finden ist. Dieser Komplex interagiert spezifisch mit CulA und unterstützt dessen Neddylierung. Der Komplex bindet jedoch keine anderen Culline. CanA von A. fumigatus bindet neben CulA auch CulC E3 Ligasen. Die Aspergillus-spezifische CandA-C1 Untereinheit hat im Vergleich zu den anderen beiden CandA Proteinen gemeinsame und unterschiedliche Funktionen. Diese Arbeit zeigt, dass CandA-C1 von A. nidulans für das vegetative Wachstum, die Reifung der Kleistothecien und der damit verbundenen Ascosporenbildung sowie der Aktivierung der Ubiquitinmarkierungs-Systeme verantwortlich ist. Anders als CandA-N und CandA-C hat CandA C1 keinen Einfluss auf den Sekundärmetabolismus von Orsellinsäure-Derivaten. Der N-terminale Bereich des A. fumigatus CanA ist genauso wichtig für die Sporenkeimung und das vegetative Wachstum wie CandA C1 von A. nidulans. Diese Ergebnisse machen die Aspergillus-spezifische CandA/CanA Untereinheit zu einem interessanten Kandidaten für die Medikamentenforschung gegen Pilzinfektionen bei zum Beispiel immungeschwächten Patrienten mit bronchopneumonaler Aspergillose verursacht durch A. fumigatus, ohne dabei das menschliche Ubiquitin-Proteasome-System zu beeinträchtigen.
 
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