Diagnostische und funktionelle Relevanz neutraler Sphingomyelinasen bei der Sekretion extrazellulärer Vesikel aus Prostatakarzinomzellen
Diagnostic and functional role of neutral sphingomyelinases in extracellular vesicle secretion from prostate carcinoma cells
by Jan-Moritz Plum
Date of Examination:2022-02-09
Date of issue:2022-02-01
Advisor:Prof. Dr. Julia Groß
Referee:Prof. Dr. Julia Groß
Referee:Prof. Dr. Claudia Binder
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-23
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Abstract
English
The prostate carcinoma is the most common malignant tumour disease in men. Despite good early detection and treatment options, prostate carcinoma remains the second most common cause of tumour-related death in Germany. Malignant tumours utilise extracellular vesicles to support various processes needed for their progression and metastasis. Neutral sphingomyelinases, as well as being involved in lipid metabolism and apoptosis, play an important role in the secretion of extracellular vesicles. The aim of this work is to investigate the diagnostic and functional relevance of neutral sphingomyelinases (nSmase 1+2) in the secretion of extracellular vesicles from prostate carcinoma cells. Immunohistochemical staining of tissue arrays revealed a correlation between metastasis and increased nSmase2 expression. Since increased nSmase2 activity correlates with increased ceramide production and thus increased apoptotic pressure, mutation-induced functional impairment of the SMPD2 gene product, as is present in up to 17% of prostate carcinomas, could be a survival mechanism for tumours. This functional impairment was simulated by treating the cells with the neutral sphingomyelinase inhibitor GW4869. The vesicle secretion behaviour of the prostate cancer cell lines PC3 and Du145 changed when the neutral sphingomyelinases were inhibited. For instance, for the p100 fraction of PC3 cells, we observed a statistically significant increase in the amount of vesicles, which rose to 3 to 4 times that of the control group. Furthermore, in the wound healing assay, PC3 cells previously treated with the inhibitor GW4869 closed the inflicted wound much faster than those of the control group. The neutral sphingomyelinases were therefore functionally relevant not only to the secretion of vesicles, but also to the migration behaviour of the investigated cells. The results of a mass spectrometric analysis of vesicles from cells previously treated with GW4869 revealed a correlation between functional and diagnostic relevance. The protein SRPX2 was found to be present in greater quantity on vesicles of PC3 cells treated with GW4869, and was shown to be a theoretically suitable biomarker candidate. In current research, this protein is associated with tumour progression and metastasis as well as the accelerated migration of tumour cells. It could therefore be responsible for the altered migration behaviour of the PC3 cells treated with GW4869. It is possible to filter extracellular vesicles out of blood, and detection of SRPX2 on extracellular vesicles could conceivably be a diagnostic tool for certain molecular genetic tumour tissue configurations. We succeeded in showing that neutral sphingomyelinases are functionally relevant to the migration behaviour of prostate carcinoma cells, and to their secretion of extracellular vesicles.
Keywords: Prostate Carcinoma; Extracellular vesicles; Neutral Sphingomyelinases
German
Prostatakarzinome stellen die häufigste maligne Tumorerkrankung bei Männern dar. Trotz guter Früherkennungs- und Behandlungsmöglichkeiten ist das das Prostatakarzinom die zweithäufigste tumorbedingte Todesursache in Deutschland. Bösartige Tumoren nutzen extrazelluläre Vesikel, um diverse, für ihren Progress und ihre Metastasierung nötige, Prozesse zu unterstützen. Neutrale Sphingomyelinasen spielen, neben ihrer Beteiligung an Lipidstoffwechsel und Apoptose, in der Sekretion extrazellulärer Vesikel eine wichtige Rolle. Ziel dieser Arbeit war es, die funktionelle und diagnostische Relevanz neutraler Sphingomyelinasen (nSmase 1+2) bei der Sekretion extrazellulärer Vesikel aus Prostatakarzinomzellen zu untersuchen. In immunohistochemischen Färbungen von tissue arrays zeigte sich eine Korrelation zwischen Metastasierung und erhöhter nSmase2-Expression. Da erhöhte nSmase2-Aktivität mit erhöhter Ceramidproduktion und damit erhöhtem Apoptosedruck einhergehen, könnte eine, durch Mutation bedingte, Funktionseinschränkung des SMPD2-Gen-Produkts, wie sie in bis zu 17% der Prostatakarzinome vorliegt, einen Überlebensmechanismus für Tumoren darstellen. Diese Funktionseinschränkung wurde mit der Behandlung der Zellen mit dem Inihibitor der neutralen Sphingomyelinasen GW4869 simuliert. Es zeigte sich, dass sich das Vesikelsekretionsverhalten der Prostatakrebszelllinien PC3 und Du145 unter Inhibition der neutralen Sphingomyelinasen änderte. Für die p100-Fraktion von PC3-Zellen ließ sich beispielsweise eine statistisch signifikante Zunahme der Vesikelmenge um das 3–4fache der Kontrollgruppe feststellen. Weiterhin verschlossen PC3-Zellen, die zuvor mit dem Inhibitor GW4869 behandelt wurden, im wound healing assay die zugefügte Wunde sehr viel schneller, als diejenige Zellen der Kontrollgruppe. Eine funktionelle Relevanz der neutralen Sphingomyelinasen ist also nicht nur in der Sekretion der Vesikel gegeben, sondern auch im Migrationsverhalten der untersuchten Zellen. Einen Zusammenhang zwischen funktioneller und diagnostischer Relevanz brachten die Ergebnisse der massenspektrometrischen Analyse von Vesikeln aus zuvor mit GW4869 Zellen. Dabei zeigte sich das Protein SRPX2 sowohl vermehrt auf Vesikeln mit GW4869 behandelter PC3 Zellen, als auch als theoretisch geeigneter Biomakerkandidat. Das Protein wird in aktueller Forschung mit Tumorprogress und Metastasierung sowie beschleunigter Migration von Tumorzellen in Verbindung gebracht. Dieses Protein könnte also für das Veränderte Migrationsverhalten der GW4869 behandelten PC3 Zellen verantwortlich sein. Eine Aufreinigung extrazellulärer Vesikel aus Blut ist möglich und unter bestimmten molekulargenetischen Konstellationen des Tumorgewebes wäre ein Nachweis von SRPX2 auf extrazellulären Vesikeln als diagnostisches Mittel denkbar. Es konnte gezeigt werden, dass neutrale Sphingomyelinasen funktionelle Relevanz im Migrationsverhalten von-, sowie bei der Sekretion extrazellulärer Vesikel aus, Prostatakarzinomzellen haben.
Schlagwörter: Prostatakarzinome; Extrazelluläre Vesikel; Neutrale Sphingomyelinasen