| dc.description.abstractger | Pappeln sind als ein Modell-Organismus für die Forschung an Bäumen etabliert. Populus trichocarpa war die erste vollständig sequenzierte Baumart. Trotzdem werden im Labor häufig andere Pappelarten für Experimente verwendet, da Populus trichocarpa nur schwer transformierbar ist. Zum Beispiel lassen sich Pappeln der Art Populus x canescens (eine natürliche Hybride aus P. tremula x P. alba) leichter unter Laborbedingungen kultivieren und transformieren.
Aufgrund ihres schnellen Wachstums und ihrer relativ einfachen Vermehrung sind Pappeln auch von wirtschaftlichem Interesse für die Holz-verarbeitende Industrie und werden als erneuerbare Energiequelle für die Produktion von Biotreibstoff und Biogas genutzt. Pappeln können in Kurzumtriebsplantagen angebaut werden und bereits innerhalb weniger Jahre eine große Menge an Biomasse produzieren. Allerdings besteht die Gefahr, dass der Befall mit Schädlingen das Wachstum der Bäume erheblich einschränkt. Rostpilze der Gattung Melampsora sind weit verbreitete Krankheitserreger, die zu den Hauptursachen für einen geringen Biomassezuwachs infizierter Pappelplantagen zählen, da der Befall mit diesen Pilzen einen verfrühten Blattabfall sowie ein vermindertes Stammwachstum bewirkt.
Pflanzen sind in der Lage schädliche Organismen mit Hilfe von Rezeptoren zu erkennen, die spezifisch für sogenannte Pathogen-assoziierte molekulare Muster sind (PAMPs). Die Erkennung solcher Pathogen-assoziierten molekularen Muster löst verschiedene Abwehrmechanismen aus. Ein Beispiel ist die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oder die Aktivierung von Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) Signalkaskaden, um die Expression von Abwehrgenen zu initiieren. Lysin-Motiv Rezeptor-ähnliche Kinasen (LysM-RLKs) oder Lysin-Motiv Rezeptor-ähnliche Proteine (LysM-RLPs) spielen eine wesentliche Rolle für die Erkennung pilzlicher Erreger. Sie binden Moleküle, die N Acetylglucosamin enthalten, und somit auch Chitin, ein Homopolymer aus β-1,4-glycosidisch verknüpften N-Acetylglucosamin, welches ein Hauptbestandteil der pilzlichen Zellwand ist.
Welche Rezeptoren in Pflanzen für die Chitinerkennung verantwortlich sind, ist am besten in Arabidopsis und Reis erforscht. In Arabidopsis besteht der Chitin-bindende Rezeptor-Komplex aus der LysM-RLK „CHITIN ELICITOR RECEPTOR KINASE 1“ (AtCERK1) und zwei weiteren LysM-RLKs, LYK4 und LYK5. In Reis ist das LysM-RLP „CHITIN ELICITOR BINDING PROTEIN“ (OsCEBiP) essentiell für die Chitin-Erkennung. Allerdings ist auch in Reis die LysM-RLK OsCERK1 ein wichtiger Co-Rezeptor von OsCEBiP.
In dieser Dissertation wurde untersucht, welche LysM-RLKs oder LysM-RLPs eine Rolle für die Chitin-vermittelte Immunantwort in der Pappel spielen. Es konnte mit Hilfe einer phylogenetischen Analyse gezeigt werden, dass das Genom von Populus trichocarpa für homologe Proteine von allen bereits bekannten LysM-RLKs und LysM-RLPs aus den vier verschiedenen Modelorganismen Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Medicago truncatula und Lotus japonicus kodiert. Um von diesen homologen Proteinen diejenigen zu identifizieren, die die Fähigkeit haben Chitin zu binden, wurde die potentielle Chitin-Affinität der Zielproteine zur Aufreinigung von Proteinproben genutzt, welche anschließend mittels Massenspektrometrie analysiert wurden. Es wurden dabei sowohl Proben von Populus trichocarpa als auch von Populus x canescens verwendet. Es stellte sich heraus, dass CERK1 auch in der Pappel ein Hauptkandidat unter den LysM-RLKs ist, welche wahrscheinlich an der Chitinerkennung beteiligt sind. In-silico Analysen der Protein-Domänen von zwei paralogen CERK1 Genen, PcCERK1-1 und PcCERK1-2, aus Populus x canescens, weisen für beide Gene darauf hin, dass diese potentiell funktionale LysM-RLKs mit Kinaseaktivität sind. Daher wurde die Funktion untersucht, die diese Paraloge in der Chitin-induzierten Produktion von ROS und MAPKinasen-Aktivierung haben. Dafür wurden einerseits Komplementationsstudien in der Arabidopsis-Mutante Atcerk1, welche nicht mehr in der Lage ist, auf Chitin zu reagieren, durchgeführt und andererseits Pappelmutanten untersucht, in denen beide Gene durch Gen-Knockouts ausgeschaltet wurden. In der Atcerk1 Mutante konnte mit dem PcCERK1-2 Gen nur teilweise die durch Chitin ausgelöste MAPK-Aktivierung wiederhergestellt werden. Die Ergebnisse der Pappel-Knockout-Mutanten deuten jedoch auf eine Funktion beider PcCERK1-Gene bei der Chitin-Signalübertragung hin. Als mögliche Gründe für die fehlende Fähigkeit von PcCERK1-1 die Atcerk1 Linie zu komplementieren und von PcCERK1-2 den ROS burst von Atcerk1 wiederherzustellen, werden Aminosäuresubstitutionen zwischen AtCERK1 und PcCERK1-1/PcCERK1-2 diskutiert, die möglicherweise die Konformation des Proteins derart verändern, dass die Signalweiterleitung vom Rezeptor nicht mehr möglich ist, da die Bindung der dafür notwendigen Arabidopsis-Interaktionspartner beeinträchtigt ist.
Für die Pccerk1-1 und Pccerk1-2 Einzel-Knockouts in der Pappel wurde jeweils eine normale ROS-Burst-Reaktion nach der Chitinbehandlung nachgewiesen, während in der Pccerk1-1 Pccerk1-2 Doppel-Knockout-Mutante gar kein ROS-Burst mehr sichtbar war. Daher wurde für beide Gene auf eine redundante Funktion bei der Erzeugung von ROS nach Chitin-Wahrnehmung geschlossen. Im Gegensatz dazu, konnte nachgewiesen werden, dass die MAPK-Aktivierung in mit Chitin behandelten Blattproben überwiegend von PcCERK1-1 abhängt. In den Pccerk1-1 Einzel-Knockout Pflanzen war die durch Chitin ausgelöste MAPK-Reaktion stark beeinträchtigt, während die Pccerk1-2 Einzel-Knockout Pflanzen immer noch eine wildtypähnliche Reaktion aufwiesen. Das schwache MAPK-Restsignal im Pccerk1-1 Einzel-Knockout wurde vermutlich durch PcCERK1-2 verursacht, da die Doppel-Knockout Pflanzen gar keine Chitin-induzierte MAPK-Aktivierung aufwiesen. Interessanterweise zeigte eine Expressionsanalyse, dass PcCERK1-1 in Blättern signifikant höher exprimiert wird als PcCERK1-2. Somit deuten die Ergebnisse der Funktionsanalyse und die Expressionsdaten darauf hin, dass die Chitinperzeption im Wesentlichen durch PcCERK1-1 vermittelt wird.
Als Alternative zu der Erstellung der Knockout Pflanzen wurde getestet, ob die Überexpression eines modifizierten PcCERK1-1 Gens mit funktionsloser Kinasedomäne (Pccerk1 1_LOF; LOF: loss of function) einen dominant negativen Effekt auf die Chitin-vermittelte Signalweiterleitung hat. Es konnte jedoch nur eine geringfügig verminderte Signalstärke für ROS-Burst oder MAPKinase Aktivierung festgestellt werden. Vermutlich liegt dies an einer zu niedrigen Expressionsrate von Pccerk1 1_LOF, da derselbe Versuch in Arabidopsis in den Atcerk1_LOF Überexpressions-Linien zu einem kompletten Verlust der Chitin-induzierten ROS Produktion und MAPK-Aktivierung führte. Außerdem könnten auch homodimere Rezeptorkomplexe mit PcCERK1-2 immer noch funktional sein. Allerdings liefert dieses Experiment trotzdem einen Hinweis darauf, dass PcCERK1-1 tatsächlich die bereits durch die in-silico Analyse vermutete Kinaseaktivität aufweist und diese wichtig für die Signalweiterleitung ist.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass beide PcCERK1 Gene an durch Chitin ausgelösten Abwehrreaktionen beteiligt sind. PcCERK1-1 und PcCERK1-2 scheinen beide eine redundante Funktion für die ROS Produktion zu haben. Im Gegensatz dazu hat eine funktionale Diversifizierung der Paraloge hinsichtlich MAPK-Aktivierung stattgefunden, welche hauptsächlich durch PcCERK1-1 vermittelt wird. | de |
| dc.description.abstracteng | Poplar trees have been established as a model organism to study woody perennial plants. The first fully sequenced tree species was Populus trichocarpa. Nevertheless, for experiments in the laboratory often other Populus species are used that are less recalcitrant to transformation than Populus trichocarpa. Amongst others, Populus x canescens, a natural hybrid of P. tremula x P. alba, is a species that is much easier transformable.
Due to their fast growth and easy propagation, poplars are also of commercial interest for the pulp and paper industry and serve as a renewable energy resource for the production of biofuel and biogas. Poplars can be planted in short rotation coppices and produce a high amount of biomass within a few years. However, poplar plantations suffer from different pathogens that significantly impair plant growth. Rust fungi of the genus Melampsora are a class of pathogens responsible for major biomass losses due to infection-induced early defoliation as well as a decrease of stem height and stem diameter.
Plants recognize microbes with the help of receptor complexes that are specific for pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). The detection of PAMPs leads to defense reactions like the activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling cascades to activate defense genes and the generation of reactive oxygen species (ROS). Lysin motif receptor-like kinases (LysM-RLKs) and lysin motif receptor-like proteins (LysM-RLPs) play a crucial role for the recognition of fungal pathogens. They are able to bind different N acetylglucosamine containing molecules and thus also bind the β 1,4-linked N acetylglucosamine homopolymer chitin which is the major component of the fungal cell wall.
Plant receptors that are involved in chitin perception are best studied in Arabidopsis and rice. In Arabidopsis, chitin is detected by a receptor complex consisting of the LysM-RLK CHITIN ELICITOR RECEPTOR KINASE 1 (AtCERK1) and two other LysM-RLKs, LYK4 and LYK5. In rice the LysM-RLP CHITIN ELICITOR BINDING PROTEIN (OsCEBiP) is the major chitin receptor. However, chitin-triggered responses are dependent on association of OsCEBiP with OsCERK1.
In this thesis, LysM-RLKs or LysM-RLPs that play a role for chitin perception in poplar were identified. A phylogenetic analysis revealed that the Populus trichocarpa genome encodes homologs of all known LysM-RLKs and LysM-RLPs described in the model organisms Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Medicago truncatula and Lotus japonicus. Mass spectrometry analyses of chitin affinity purified protein samples from Populus trichocarpa and Populus x canescens were performed to identify LysM-RLKs or LysM-RLPs with a potential function in chitin binding and perception. Poplar CERK1 turned out to be the main candidate for a key component of the poplar chitin receptor. In-silico analyses of the protein domains of the two paralogous CERK1 genes, PcCERK1-1 and PcCERK1-2, which are present in Populus x canescens, suggested that both genes encode functional LysM-RLKs with kinase activity. A functional analysis evaluating the role of the PcCERK1 paralogs in ROS burst and MAPK activation was carried out with complementation studies of a chitin-insensitive Arabidopsis Atcerk1 mutant and CRISPR/Cas9 generated knockout mutants in poplar. Complementation could only be accomplished for the PcCERK1 2 gene that partially restored the chitin-triggered MAPK activation of Atcerk1. However, the results from the poplar knockout mutants suggest a function for both PcCERK1 genes in both chitin signaling processes. As possible reason for the lack of complementation ability of PcCERK1-1 and the lack of ROS burst complementation for PcCERK1-2, amino acid substitutions between AtCERK1 and PcCERK1-1/PcCERK1-2 are discussed that might lead to conformational changes and thus impair interaction of PcCERK1 proteins with downstream components of the Arabidopsis signal transduction.
Poplar leaves of Pccerk1-1 and Pccerk1-2 single knockouts both had a normal ROS burst response after chitin treatment whereas in the Pccerk1-1 Pccerk1 2 double knockout mutant the chitin-triggered ROS burst was completely abolished. Therefore, a redundant function for both genes mediating the generation of ROS after chitin perception was concluded. MAPK activation in chitin elicitor treated leaf samples was shown to be predominantly dependent on PcCERK1-1. In the Pccerk1-1 single knockout the chitin-triggered MAPK response was strongly impaired while the Pccerk1-2 single knockout showed a wildtype-like response. The slight residual MAPK activation in the Pccerk1-1 single knockout was supposed to be caused by PcCERK1-2 since in the double knockout the ability for chitin-induced MAPK signaling was entirely lost. In leaves PcCERK1-1 has been shown to be significantly higher expressed than PcCERK1 2. Thus, functional analyses and expression data indicate that chitin signaling in Populus x canescens is mainly mediated by PcCERK1-1.
In addition to the generation of gene knockouts the overexpression of a kinase dead Pccerk1 1 variant was tested as an alternative strategy for functional analysis. The overexpression was supposed to exhibit a dominant negative effect on chitin signaling. The response to chitin in regard to MAPK and ROS burst signaling was only slightly reduced in a Pccerk1-1_LOF (LOF: loss of function) overexpressor line. This was probably due to a low expression level of the Pccerk1 1_LOF variant since in Arabidopsis Atcerk1_LOF overexpressor lines chitin-triggered ROS and MAPK activation was completely abolished. Another reason might be the presence of homodimeric receptor complexes involving the second paralog PcCERK1-2 that still have signal transduction capacity. Nevertheless, the results indicate that PcCERK1-1 has the kinase activity predicted by in-silico analyses and that this kinase activity is important for signal transduction.
In conclusion, the results of this thesis show that both PcCERK1 genes are involved in chitin-triggered defense responses. PcCERK1-1 and PcCERK1-2 have maintained redundant functions in chitin-triggered ROS burst. In contrast to this, PcCERK1 paralogs show a functional diversification in chitin-triggered MAPK activation, which mainly depends on PcCERK1-1. | de |