| dc.contributor.advisor | Sehmisch, Stephan Prof. Dr. | |
| dc.contributor.author | Deppe, Delia | |
| dc.date.accessioned | 2022-04-14T11:59:57Z | |
| dc.date.available | 2022-04-28T00:50:13Z | |
| dc.date.issued | 2022-04-14 | |
| dc.identifier.uri | http://resolver.sub.uni-goettingen.de/purl?ediss-11858/13993 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9173 | |
| dc.language.iso | deu | de |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ | |
| dc.subject.ddc | 610 | de |
| dc.title | Analyse der RANKL-Inhibition durch Virus-like Partikel vermittelte RNA-Interferenz im Osteoporose-Modell der Ratte | de |
| dc.type | doctoralThesis | de |
| dc.title.translated | Effects of RANKL Knockdown by Virus-like Particle-Mediated RNAi in a Rat Model of Osteoporosis | de |
| dc.contributor.referee | Hoffmann, Daniel PD Dr. | |
| dc.date.examination | 2022-04-20 | de |
| dc.description.abstractger | Eine effektive Behandlung der postmenopausalen Osteoporose stellt die Medizin immer noch
vor eine große Herausforderung und es bedarf weiterer Forschung zu den Prinzipien der verschiedenen Behandlungsoptionen. Bei der postmenopausalen Osteoporose ist vor allem der trabekuläre Knochenanteil (distale Radius, Oberschenkelhals, Wirbelkörper, proximale Tibiae) betroffen. Der Rezeptoraktivator des NF-kB-Ligand/Osteoprotegerin-Systems
(RANKL/RANK/OPG-System) spielt eine Hauptrolle in der Regulierung der Knochenbildung und des Knochenstoffwechsels. Aufgrund dieser Erkenntnis wurde in den letzten Jahren der monoklonale RANKL-Antikörper Denosumab zur Behandlung der postmenopausalen Osteoporose sowie für Knochentumore eingesetzt. Die Behandlung mit Denosumab führt zu einer Reduktion des Knochenabbaus. Jedoch hemmt die systemische Gabe des Antiköpers (Denosumab) die RANKL Synthese nicht spezifisch am Knochen, sondern wirkt auf den gesamten Organismus, was zu schwerwiegenden systemischen Nebenwirkungen führen kann. Des Weiteren führt das Absetzen von Denosumab zu Rebound-assoziierten Wirbelfrakturen. Eine neue und vielversprechende Lösung für dieses Problem ist die Verwendung von Virus-like particles
(VLPs), welche mit RANKL-siRNA beladen werden und als Ersatztherapie zu Denosumab in Frage kommen. Als Zellaufnahmerezeptor wurde der Serotonin-5-Hydroxytryptamin-Rezeptor (5-HT2a-Rezeptor) genutzt. Dieser Rezeptor ist sowohl bei Menschen als auch bei Ratten vorhanden und an der Knochenbildung beteiligt. Die Versuche wurden an 56 weiblichen Spraque-Dawley Ratten durchgeführt. Im Alter von drei Monaten wurde bei 48 Ratten eine bilaterale Ovariektomie durchgeführt. Die Entfernung der
Ovarien und dem draus resultierenden Östrogenmangel führte zu einem osteoporotischen Knochenverlust. Die acht nicht ovariektomierten Tiere stellten die intakten Tiere da. Die Versuchstiere wurden in sieben unterschiedliche Gruppen zu je acht Tieren unterteilt, wovon 48 Tiere entweder mit 17ß-Estradiol, VLPs und RANKL-siRNA oder mit VLPs und Kontroll-siRNA behandelt wurden
(n = 8/Gruppen). Die Injektion der beladenen VLPs mit RANKL-siRNA
und Kontroll-siRNA erfolgte intraperitoneal mit Einzeldosen von 150 µg VLP-Injektion (0,5 mg/kg KG) 1 x/Woche. Die Verabreichung des 17ß-Estradiolbenzonat erfolgte in einer oral verabreichten Dosis von 10 mg/kg Futter (0,6 mg/kg KG) täglich. Des Weiteren untersuchte diese Studie zwei verschiedene Rattenkohorten, die unterschiedliche Behandlungsoptionen erhielten. Dazu wurden die Versuchstiere nochmals in Therapie- und Prophylaxegruppen unterteilt. Die Therapiegruppe erhielt fünf Wochen nach der Ovariektomie, im frühen Stadium der Osteoporose, eine fünfwöchige Behandlung. Die Prophylaxegruppen wurden direkt nach der Ovariektomie über zehn Wochen behandelt.
Anschließend erfolgte die Versuchsauswertung mittels qPCR, Western-Blot, biomechanischer-Test und Mikro-CT an den Tibiae und Wirbelkörpern. Im Serum wurden ß-Crosslaps gemessen. Die anschließende Auswertung der ermittelten Daten erfolgte mit Hilfe von one-way ANOVA Test und mit einem Tukey-Kramer post hoc Test (p < 0,05). Die Ergebnisse zeigten bei der qPCR Analyse einen signifikanten Knockdown von RANKL-mRNA um bis zu 35% in der RANKL-siRNA Therapie- und Prophylaxegruppe. Mit der durchgeführten Western-Blot-Technik konnte ebenfalls eine Expression auf Proteineben ein den Therapiegruppen nachgewiesen werden. Die Serum-Analyse zeigte Verringerung an ß-Crosslaps, bei den nicht ovariektomierten Tieren und bei den Tieren, die mit 17ß-Estradiol behandelt wurden, gegenüber den Tieren die Kontroll-siRNA und RANKL-siRNA erhielten. Bei den Ergebnissen des biomechanischen Tests und bei der Mikro-Computertomographie-Untersuchung zeigte sich keine signifikante Verbesserung durch den RANKL-Knockdown.
In dieser Studie bestätigte sich die Möglichkeit, die Expression von RANKL in osteoporotischen Knochen durch VLP-vermittelte RNA-Interferenz zu verringern. Dennoch zeigten die Versuche, dass eine alleinige Blockierung des membranständigen RANKL keinen ausreichenden Effekt erzielt und somit das lösliche RANKL in Bezug auf den Pathomechanismus der postmenopausalen Osteoporose mit berücksichtig werden muss. Deshalb könnte es von weiterem Interesse sein, VLPs mit einem spezifischen Tropismus für mesenchymale Stammzellen, Enthodelzellen und T-Zellen zu entwerfen, um die relative Wichtigkeit der verschiedenen beitragenden Zellsysteme zu unterscheiden. Für die alleinige Knochenspezifität müsste ein neuer zellulärer Aufnahme Rezeptor geschaffen werden, damit die RANKL-Inhibition direkt und unmittelbar am Knochen angreifen kann. | de |
| dc.description.abstracteng | Postmenopausal osteoporosis is an underestimated, widespread disease. Due to demographic trends, the prevalence of osteoporosis will further increase in the next decades.The treatment of postmenopausal osteoporosis is still a challenge, and better understanding of the underlying principles of various treatment options is needed.
In postmenopausal osteoporosis, trabecular bone (e.g., distal radius, femoral neck, vertebrae, proximal tibiae) is primarily affected because of its higher bone turnover with respect to cortical bones. Cortical bone also shows bone loss, but only over a longer period of time.
In recent years, several studies suggested a major role for the receptor activator of nuclear factor κB (NF-κB) ligand/osteoprotegerin (RANKL/OPG) system to regulate bone resorption and bone metabolism. RANKL is produced among other cells by osteoblasts. Binding of RANKL to its receptor RANK on osteoclast precursors induces their differentiation into osteoclasts and thereby increases bone resorption.OPG is another important protein in this regulatory loop, which is also expressed by osteoblasts and is able to block RANKL by acting as a soluble decoy receptor.Thus, OPG decreases bone resorption, while RANKL promotes it.
Several ways of influencing the RANKL/OPG balance have been described in the literature. In recent years, the monoclonal RANKL antibody denosumab was approved for treatment of postmenopausal osteoporosis, as well as bone tumors, and showed a decrease in bone loss in several clinical studies. Upon systemic delivery, denosumab non-specifically inhibits RANKL in the whole organism. This can result in severe systemic side effects, including joint pain, myalgia, ostealgia, infectious diseases of the respiratory and the urogenital systems, gastrointestinal dysfunction, and skin irritation. Furthermore there is evidence for rebound-associated vertebral fractures following the discontinuation of denosumab. A bone-specific inhibition of RANKL could be more effective, and side effects to the whole organism could be minimized.
Using RNAi-mediated knockdown is a promising alternative path to reduce the amount of RANKL protein. Small interfering RNA (siRNA) can be used to post-transcriptionally silence the target gene. One of the main hurdles of applying siRNA-mediated knockdowns in vivo is the delivery of siRNA into the body. A new and promising solution for this problem is the use of virus-like particles (VLPs). VLPs are derived from the human JC polyoma virus and can be utilized to carry and deliver different types of molecules, including synthetic siRNAs. A tissue-specific effect can enabled by modulating the tropism through the attachment of targeting proteins to the VLP surface. Recently, we presented VLP-mediated RANKL inhibition with siRNA in healthy rats showing promising results.
The aim of this study was to evaluate the effects of RANKL knockdown by VLP-mediated RNAi in a rat model of osteoporosis. Within this scope, we investigated the effect on biomechanical and morphological properties of bone in the early stage of postmenopausal osteoporosis. Furthermore, we intended to investigate whether there are different effects of starting RANKL knockdown before versus after the onset of osteoporosis. Potential poisonous side effects of long-term siRNA delivery by VLPs in vivo were also examined. We used the ovariectomized (OVX) rat, which is a standard animal model of osteoporosis. The entry point for VLPs into osteoblasts was the 5HT-2a receptor. Osteoblasts express membranous RANKL. Thus, this study mainly evaluated the effects of membranous RANKL knockdown in osteoporosis-affected bones. | de |
| dc.contributor.coReferee | Siggelkow, Heide Prof. Dr. | |
| dc.subject.ger | RANKL-Inhibition, VLPs, RNA-Interferenz | de |
| dc.subject.eng | RANKL osteoporosis VLP RNA interference | de |
| dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-ediss-13993-6 | |
| dc.affiliation.institute | Medizinische Fakultät | de |
| dc.subject.gokfull | Orthopädie (PPN619876204) | de |
| dc.description.embargoed | 2022-04-28 | de |
| dc.identifier.ppn | 1799695808 | |