Einfluss von prä-analytischen Entnahme- und Lagerungsbedingungen auf die Stabilität und Konzentration von Amyloid-ß-Peptiden in Blut
The Influence of Sampling and Storage Condition on the Stability and Concentration of the Amyloid-ß Peptides in Blood
von Marlena Walter
Datum der mündl. Prüfung:2022-07-19
Erschienen:2022-06-29
Betreuer:Prof. Dr. Jens Wiltfang
Gutachter:Prof. Dr. Jens Wiltfang
Gutachter:Prof. Dr. Inga Zerr
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Name:Dissertation_Marlena_Walter.pdf
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Format:PDF
Zusammenfassung
Englisch
In an increasingly aging population, age-related diseases such as dementia play a central role. Expecting an increase of the number of patients suffering from dementia worldwide, dementia-related research is becoming more important than ever. The current research focuses on possible therapy options and the diagnosis of dementia. Especially, the most common form of dementia, Alzheimer's dementia (AD), is the focus of current studies. In addition to clinical and imaging criteria, AD diagnostics also include determination of dementia-specific cerebro spinal fluid biomarkers developed in the current guidelines. In recent years, it was shown that pathological altered biomarkers, such as amyloid-ß peptides (Aß peptides), also in the blood can serve as potential biomarkers. Detection of blood-based biomarkers provides a less invasive method in AD diagnostics and plays a particularly important role in early detection of AD patients. Due to the lack of standardized protocols for handling blood samples in AD diagnostics and discrepancies of measured results between different laboratories, the intention of the present study is to investigate the influence of pre-analytical sampling and storage conditions on stability and concentration of the blood-based biomarkers, the Aß peptides. For this purpose, venous and capillary blood are obtained under different storage conditions for a period of up to three days. The biomaterial comes from both young and healthy controls as well as from patients with clinically diagnosed AD from the Clinic for Psychiatry and Psychotherapy at the University Medical Center Göttingen. The biomaterial is stored both at room temperature and at 4°C. The influence of dynamic storage is investigated by storage on a shaking plate. After two, four, six, eight, 24, 48 and 72 hours after blood collection, the blood samples are centrifuged, aliquoted and stored at -80°C until Aß measurement. The blood sample at time T0 is defined as the blood sample centrifuged within half an hour after blood collection. The measured Aβ peptide concentrations are related and normalized to time T0. The Aβ peptide concentrations are measured using the Meso Scale Discovery V-Plex immunoassay. The present thesis shows that various pre-analytical factors, such as the storage temperature and storage under dynamic conditions, are affecting the stability and concentration of the Aß peptides in blood. In particular, a reduced storage temperature of 4°C seems to have a remarkable effect on high concentration stability of the Aß peptides up to three days. This study shows for the first time that, in addition to venous blood biomaterial capillary blood can also be used to detect AD-specific biomarkers. A high correlation of Aβ peptides concentrations between capillary and venous blood is observed. In comparison to venous blood, however, in capillary blood the concentrations of Aß peptid 40 and 42 are significantly lower. Correspondingly the Aß42/40 ratio shows a long-lasting stability in capillary blood compared to venous blood. An important finding for the pre-analytical handling of biomaterial in AD diagnostics is an increased stability of the Aß peptide concentrations at reduced storage temperatures. To overcome existing discrepancies between different laboratories in the Aß peptides quantification from blood samples the establishment of a standardized pre-analytical protocol is unavoidable. In this case, a reduced storage temperature should be included in the standardization of the pre-analysis of blood samples. The increased stability of the Aß peptides concentration under reduced temperature could be due to reduced protein aggregation on the one hand. On the other hand, a temperature-dependent reduced protease activity could explain this finding and should be discussed. In addition to pre-analytical factors influencing the Aß peptide concentrations the present work explores the potential use of capillary blood in diagnosing Alzheimer's dementia. For the first time, Aß peptides were detected successfully in capillary blood. The significantly lower Aβ peptides concentrations in capillary blood compared to venous blood could be due to a dilution effect explained by a leakage from interstitial fluid into the blood sample. The reduced stability over time of the Aß peptide concentrations in capillary blood compared to venous blood points to other pre-analytical factors in the capillary blood. Dealing with capillary blood as a potentially suitable biomaterial for future AD diagnostics requires further research on answering pre-analytical and analytical questions. In summary, the findings of the present study serve to establish blood-based biomarkers in the diagnosis of AD.
Keywords: Alzheimer's disease; dementia-specific Biomarkers; blood-based Biomarkers; Amyloid-beta peptides; pre-analytical factors
Deutsch
In einer immer älter werdenden Weltbevölkerung spielen altersbedingte Erkrankungen, wie die Demenzerkrankungen, eine zentrale Rolle. Auf Grund der in den kommenden Jahrzehnten zu erwartend steigenden Anzahl an Demenzerkrankten weltweit, ist die Erforschung dementieller Krankheitsbilder wichtiger denn je. Im Fokus der aktuellen Forschung steht neben potentiellen Therapieoptionen auch die Diagnostik der Demenzerkrankungen. Insbesondere die häufigste Demenzform, die Alzheimer-Demenz (AD), steht im Mittelpunkt aktueller Studien. Neben klinischen und bildgebenden Kriterien sind in der AD-Diagnostik die Bestimmung von demenz-spezifischen Liquor-Biomarkern in den aktuellen Leitlinien etabliert. In den letzten Jahren konnte in zahlreichen Studien gezeigt werden, dass die im Liquor pathologisch veränderten Biomarker, wie z. B. die Amyloid-ß-Peptide (Aß-Peptide), auch im Blut als potentielle Biomarker dienen können. Der Nachweis von blutbasierten Biomarkern stellt eine weniger invasive Methode in der AD-Diagnostik dar und spielt insbesondere in der Früherkennung von AD-Patienten eine wichtige Rolle. Auf Grund von fehlenden standardisierten Protokollen zum Umgang mit Blutproben in der AD-Diagnostik und Diskrepanzen der Messergebnisse zwischen verschiedenen Laboratorien, soll im Rahmen der vorliegenden Arbeit der Einfluss von prä-analytischen Lagerungs- und Entnahmebedingungen auf die Stabilität von den blutbasierten Biomarkern, den Aß-Peptidkonzentrationen, untersucht werden. Hierzu wird in der vorliegenden Arbeit sowohl venöses als auch kapilläres Blut gewonnen, welches unter verschiedenen Lagerungsbedingungen über einen Zeitraum von bis zu drei Tagen gelagert wird. Das Biomaterial entstammt dabei sowohl von vorwiegend jungen und gesunden Kontrollprobanden als auch zum Teil von Probanden mit klinisch diagnostizierter AD aus der Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie der Universitätsmedizin Göttingen. Die Lagerung des Biomaterials geschieht sowohl bei Raumtemperatur als auch bei 4°C. Durch Lagerung auf einer Schüttelplatte wird der Einfluss dynamischer Lagerung untersucht. Nach zwei, vier, sechs, acht, 24, 48 und 72 Stunden nach der Blutentnahme werden die gelagerten Blutproben zentrifugiert, aliquotiert und bei -80°C bis zur Aß-Messung aufbewahrt. Die Blutprobe zum Zeitpunkt T0 wird definiert als die Blutprobe, die innerhalb einer halben Stunde nach Blutentnahme zentrifugiert und eingefroren wurde. Die gemessenen Aß-Peptidkonzentrationen werden auf den Zeitpunkt T0 bezogen und normiert. Die Messung der Aß-Peptidkonzentrationen erfolgt dabei mit dem V-Plex-Immunoassay der Firma Meso Scale Discovery. Die statistische Auswertung der gemessenen Daten wird unter Verwendung des Programms GraphPad PRISM durchgeführt. Die vorliegende Dissertation zeigt, dass verschiedene prä-analytische Faktoren, wie die Lagerungstemperatur und die Lagerung unter dynamischen Bedingungen, die Stabilität der Aß- Peptidkonzentrationen in Blut beeinflussen. Insbesondere eine erniedrigte Lagerungstemperatur von 4°C scheint den größten positiven Effekt auf eine hohe zeitliche Konzentrationsstabilität der Aß-Peptide zu haben. Unter einer erniedrigten Lagerungstemperatur zeigen sowohl Vollblut- als auch Plasmaproben stabile Aß-Peptidkonzentrationen von über drei Tagen. Erstmals wird im Rahmen dieser Studie gezeigt, dass neben venösem Blutbiomaterial auch kapilläres Blut zum Nachweis AD-spezifischer Biomarker verwendet werden kann. Eine hohe Korrelation der Aß-Peptidkonzentrationen ist zwischen kapillärem und venösem Blut zu erkennen. Im Vergleich zum venösen Blut sind jedoch in Kapillarblut die Konzentrationen der einzelnen Aß-Peptide signifikant niedriger. Eine entsprechend hohe zeitliche Stabilität in Kapillarblut im Vergleich zum venösen Blut zeigt dabei die Aß42/40-Ratio. Eine wichtige Erkenntnis für die prä-analytische Handhabung von Biomaterial in der ADDiagnostik ist eine erhöhte Stabilität der Aß-Peptidkonzentrationen bei erniedrigter Lagerungstemperatur. Zur Überwindung bestehender Diskrepanzen zwischen verschiedenen Laboratorien in der Aß-Peptidquantifizierung aus Blutproben ist eine Etablierung eines standardisierten prä-analytischen Protokolls unumgänglich. Hierbei sollte eine erniedrigte Lagerungstemperatur bei der Standardisierung der Präanalytik von Blutproben berücksichtigt werden. Die erhöhte Konzentrationsstabilität der Aß-Peptide unter erniedrigter Temperatur könnte zum einen durch eine verminderte Proteinaggregation begründet sein, zum anderen wäre eine temperaturabhängig reduzierte Proteaseaktivität zu diskutieren und weiter zu erforschen. Neben prä-analytischen Einflussfaktoren auf die Aß-Peptidkonzentrationen zeigt die vorliegende Arbeit die potentielle Verwendung von Kapillarblut in der Alzheimer-Demenz- Diagnostik. Erstmals ist im Rahmen dieser Dissertation der Nachweis von Aß-Peptiden in Kapillarblut gelungen. Die signifikant niedrigeren Aß-Peptidkonzentrationen in kapillärem Blut verglichen mit venösem Blut könnten auf einen Verdünnungseffekt zurückzuführen sein. Durch die Gewinnung des Kapillarblutes kann es zu einem vermehrten Austritt von interstitieller Flüssigkeit kommen, welches eine Verdünnung der Blutprobe bedingen kann. Die im Vergleich mit venösem Blut verminderte zeitliche Stabilität der Aß-Peptidkonzentrationen lässt auf weitere prä-analytische Einflussfaktoren im Kapillarblut hinweisen. Die Beantwortung prä-analytischer und analytischer Fragen im Umgang mit Kapillarblut als potentiell geeignetes Biomaterial der zukünftigen AD-Diagnostik bedarf weiterer Forschung. Zusammenfassend dienen die Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit der Etablierung von blutbasierten Biomarkern in der Diagnostik der AD.
Schlagwörter: Alzheimer Demenz; Demenz-Diagnostik; Demenz-spezifische Biomarker; blutbasierte Biomarker; Amyloid-beta-Peptide; prä-analytische Einflussfaktoren