Genetic analyses of the resistance of faba beans (Vicia faba) to the fungus Ascochyta fabae

Genetic analyses of the resistance of faba beans (Vicia faba) to the fungus Ascochyta fabae

von Rabia Faridi
Dissertation
Datum der mündl. Prüfung:2022-03-25
Erschienen:2022-07-26
Betreuer:Dr. Wolfgang Link
Gutachter:Dr. Birger Koopmann
Gutachter:Dr. Antje Schierholt
Gutachter:Prof. Dr. Gunter Backes
Zum Verlinken/Zitieren: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9365

 

 

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Zusammenfassung

Englisch

Climate warming is a huge challenge for agronomists, although it may offer opportunities to new crops and new types of old crops, such as winter types in so far spring-sown species. In Germany, mostly spring faba beans (Vicia faba L.) are grown. The currently improved winter hardiness of winter faba beans catches up with the upcoming milder German winters. Such autumn-sown beans are a novelty for farmers. The improvement of winter faba beans’ genetic defence against important biotic stresses such as Ascochyta blight will allow their inclusion into German crop rotations. Ascochyta blight is caused by the fungus Ascochyta fabae; severe yield losses were re-ported in susceptible cultivars of faba beans. Traditionally, the disease is controlled by avoiding sowing Ascochyta infected seed. The genetic improvement of Ascochyta blight resistance through conventional breeding is demanding and laborious, because of complex inheritance, low heritability (h2) and frequent calamities with uneven infection levels in the field situation. Several sources of Ascochyta resistance have already been described. However, the genes for resistance and their mode of action are still not identified. A resistance gene pyramiding approach would be helpful but relies on the identification of markers tightly linked to the resistance genes (or, better, on the identification of the causal alleles). Such QTL identification heavily depends upon the accuracy of phenotypic data. With this situation as background, we performed a detailed screening and phenotyping of 224 highly homozygous lines of faba beans, including the A-set lines of the Göttingen Winter Bean Population (GWBP, 188 inbred lines; cf. Ali et al., 2016) under controlled conditions for Ascochyta resistance. Two strains of Ascochyta fabae were spray-inoculated as mixture on potted juvenile plants in greenhouse; plants were visually scored eight times in a 30 day period on leaflets and on stem, for number and size (cm) of lesions, area (%) covered by lesions and for presence of Ascochyta pycnidia at leaflet and stem. The experimental unit was one plant. The accumulated (across the eight dates) and averaged (across 12 replicates) scores per trait, were used as phenotypic data. To judge the validity of the method and to employ estimates of h² for planning, predictions (prospective heritability values) from the first two replicates and post-experiments predictions (retrospective heritability values) from all 12 replicates were generated. Based on the prospective predictions, 12 replicates were required to achieve a value of heritability higher than h²=70%, which was deemed as sufficient (the finally realized value was h²=87%). Substantial and significant genetic variation for Ascochyta-resistance traits was detected, and all eight assessed traits were seemingly genetically correlated. The strongest correlation, r= 0.93** was between no. of lesions per leaflet and area covered by the lesions per leaflet. A total of five lines (S_162-1-1-2-2, S_009-1-1-4, S_038-1-1-1-1-3-8, (Hiv/2-5 x 29H-2)-15413 and (Hiv/2-5 x 29H-2)-1-15413)) out of 224 lines performed better than the resistant line 29H. The three most susceptible lines were Manafest-2, S_232-1-1-1-16-6 and S_060-1-7. The A-set with its 188 inbred lines was utilized for our ‘guided’ genome-wide association study. The GWAS was the first genome-wide association study with a focus on Ascochyta blight in Vicia faba. The analyses were thus based on 188 faba bean inbred lines, two strains of Ascochyta fabae, and a total of 2058 DNA markers (1829 AFLP-marker and 229 SNP-marker, including 17 so-called ‘guide’ SNP-markers). The average LD among all the markers was very low (r2 = 0.0075); the number of markers probably did not match such high genetic resolution. To alleviate these limita-tions and to steer the focus towards Ascochyta blight resistance genes, the so-called guided marker approach was conducted in addition to the default genome-wide analyses. The 17 guide SNP markers were defined by alignments of locus positions of the previously published maps with our available map. In this way, nine of the markers were identified as potentially being linked to a published Ascochyta QTL. Further eight guide markers were not directly picked from a published map because the distance between the published QTL and the common markers was high. Therefore, linear regression of cM data was applied with the positions of sets of common markers, to roughly predict the positions of two of the published QTL markers in our available map. Our association study is thus a study in two layers: a genome-wide association study with all randomly chosen markers, and, included, a guided approach based on the 17 guide SNP markers. A total of 12 markers, including nine AFLP and three SNP markers displayed significant associations with six traits (number of lesions per leaflet, area covered by lesions per leaflet, presence of pycnidia per leaflet, length of the biggest lesion per leaflet, length of biggest lesion at stem, presence of pycnidia at stem; nine of these markers probably stand for new resistance genes. Significant DNA markers were found at chromosomes I, III, IV, V, and VI in the descendants of the Göttingen Winter Bean Population. The guided approach was successful: one of our 17 guide marker (Vf-Mt1g014230-001) was found significant and it is hypothesized that this SNP at chromosome III validates the previously reported QTL (Af1; chromosome III). The guided marker approach for genome-wide analyses proved to be successful in a species, where no genome sequence was available. Applied marker-assisted selection for Ascochyta resistance relies strongly on the transfer of genetic results among different faba bean populations, depending on further marker-saturation of QTL bearing chromosomal regions. The new putative resistance loci in the Göttingen Winter Bean Population recommend this germplasm as a possible source for resistance breeding.
Keywords: Ascochyta blight, Ascochta fabae; faba bean (Vicia faba L.) Fava bean; Genome wide association study (GWAS); AFLP, SNP markers; Goettingen Winter Bean Population (GWBP)

Deutsch

Die Klimaerwärmung ist eine enorme agronomische Herausforderung, obwohl sie Chancen für neue Fruchtarten und neue Fruchtartentypen bereithält, wie für Wintertypen in bislang als Som-mertypen gesäte Arten. In Deutschland werden zumeist Sommerackerbohnen (Vicia faba L.) an-gebaut. Die derzeit verbesserte Winterhärte von Winterackerbohnen trifft auf die schon kom-menden milderen Winter in Deutschland. Solche Herbst-gesäten Bohnen sind für die Landwirte eine Neuheit. Die Verbesserung der genetischen Abwehr von Winterackerbohnen gegen wichtige biotische Stressoren wie die Ascochyta-Brennfleckenkrankheit wird ihre Hereinnahme in die Fruchtfolgen in Deutschland erlauben. Die Brennfleckenkrankheit wird durch den Pilz Ascochyta fabae verursacht; von anfälligen Ackerbohnensorten wurden schwere Ertragsverluste berichtet. Die Vermeidung von Ascochyta-infiziertem Saatgut ist eine traditionelle Bekämpfungsmaßnah-me. Die erbliche Verbesserung der Brennfleckenkrankheits-Resistenz durch konventionelle Züch-tung ist wegen der komplexen Vererbung, der niedrigen Erblichkeit (h²) und wegen häufiger Kalamitäten mit inhomogenen Infektionsniveaus in der Feldsituation aufwendig und mühsam. Mehrere Quellen von Ascochyta-Resistenz sind schon beschrieben worden. Die Gene für Re-sistenz und ihre Wirkungsweise jedoch sind noch nicht identifiziert. Ein Ansatz zur Pyramid-isierung von Resistenzgenen wäre hilfreich, aber dieses setzt die Identifikation von Markern mit enger Kopplung zu den Resistenzgenen voraus (oder, besser, die Identifikation der kausalen Al-lele). Solche QTL-Identifikation hängt sehr stark von akkuraten phänotypischen Daten ab. Vor diesem Hintergrund führten wir unter kontrollierten Bedingungen eine detaillierte Durchmuster-ung und Phänotypisierung auf Ascochyta-Resistenz von 224 hoch-homozygoten Ackerbohnen-Linien durch, einschließlich der A-Satz-Linien der Göttinger Winterackerbohnenpopulation (GWBP, 188 Inzuchtlinien; cf. Ali et al., 2016). Zwei Ascochyte fabae-Stämme wurden als Mischung per Sprühinokulierung auf junge, getopfte Pflanzen im Gewächshaus aufgebracht, und die Pflanzen wurden visuell zu acht Zeitpunkten bonitiert, über eine Periode von 30 Tagen: auf Fiederblatt- und Stängelsymptome, also auf Anzahl und Größe (cm) der Läsionen, auf die Fiederblattfläche (%), die von Läsionen bedeckt war und auf das Vorhandensein von Ascochyta-Pyknidien auf Fiederblatt und Stängel. Die experimentelle Einheit war eine Pflanze. Die akkumu-lierten (über die acht Termine) und gemittelten (über 12 Wiederholungen) Boniturwerte pro Merkmal wurden als phänotypische Daten benutzt. Um die Validität der Methode einzuschätzen und um Schätzwerte für h² für die Planung zu nutzen, wurden Vorhersagen (prospektive Erblich-keitswerte) aus den ersten beiden Wiederholungen generiert, außerdem retrospektive Erblich-keitswerte (post-experimentelle Vorhersage) aus allen 12 Wiederholungen. Auf Basis der prospektiven Vorhersagen waren 12 Wiederholungen notwendig, um eine Erblichkeit von über h²=70% zu erreichen, was als ausreichend betrachtet wurde (der schlussendlich erreichte Wert war h²=87%). Es wurde eine substanzielle und signifikante erbliche Variation für Ascochyta-Resistenz detektiert, und alle acht erfassten Merkmale waren offensichtlich genetisch korreliert. Die engste Korrelation, r=0,93**, lag zwischen der Anzahl Läsionen pro Fiederblatt und der Läsions-bedeckten Fiederblattfläche vor. Insgesamt fünf Linien (S_162-1-1-2-2, S_009-1-1-4, S_038-1-1-1-1-3-8, (Hiv/2-5 x 29H-2)-15413 und (Hiv/2-5 x 29H-2)-1-15413)) der 224 Linien zeigten eine bessere Leistung als die resistente Linien 29H. Die drei anfälligsten Linien waren Manafest-2, S_232-1-1-1-16-6 und S_060-1-7. Der A-Satz mit seinen 188 Inzuchtlinien wurde für unsere ‚geführte‘ genomweite Assoziationsstudie genutzt. Die GWAS war die erste ge-nomweite Assoziationsstudie mit einem Fokus auf Ascochyta-Brennflecken in Vicia faba. Die Analysen basierten somit auf 188 Ackerbohnenlinien, zwei Ascochyta fabae-Stämmen, und einer Gesamtzahl von 2058 DNS-Markern (1829 AFLP-Markern und 229 SNP-Markern, einges-chlossen 17 sogenannte ‚Führungs‘-SNP-Marker). Das durchschnittliche LD unter allen Markern war sehr niedrig (r2 = 0,0075); die Markeranzahl entsprach vermutlich nicht dieser hohen ge-netischen Auflösung. Um diese Einschränkung abzumildern und um den Fokus zu den Asco-chyta-Resistenzgenen zu lenken, wurde zusätzlich zur standardmäßigen genomweiten Analyse der sogenannte geführte Markeransatz gewählt. Die 17 Führungsmarker wurden per Alignment von Locus-Positionen aus den vorher publizierten Karten mit unserer verfügbaren Karte definiert. Auf diesem Wege wurden neuen der Marker als potentiell mit einem publizierten Ascochyta-QTL gekoppelt identifiziert. Weitere acht Führungsmarker wurden nicht direkt aus einer publizierten Karte entnommen, weil eine hohe Distanz zwischen dem publizierten QTL und den gemeinsamen Markern vorlag. Daher wurde eine lineare Regression von cM-Daten mit den Positionen von Sätzen von gemeinsamen Markern angewendet, um annäherungsweise die Position von zwei pub-lizierten QTL-Markern in unserer verfügbaren Karte vorherzusagen. Unsere Assoziationsanlayse ist somit eine Studie in zwei Schichten: eine genomweite Assoziationsstudie mit allen, zufälligen, Markern und, darin eingeschlossen, ein geführter Ansatz, der auf 17 Führungsmarkern beruhte. Insgesamt zeigten 12 Marker, darin neun AFLP und drei SNP, eine signifikante Assoziation mit sechs Merkmalen (Läsionsanzahl pro Fiederblatt, Läsionsflächenanteil pro Fiederblatt, Läsion-slänge der größten Läsion auf Fiederblatt, auf Stängel, Vorkommen von Pyknidien auf Fieder-blatt, am Stängel; neun dieser Marker stehen vermutlich für neue Resistenzgene. Signifikante DNS-Marker wurden auf den Chromosomen I, III, IV, V und VI in den Nachkommen der Göt-tinger Winterackerbohnen-Population gefunden. Der geführte Ansatz war erfolgreich: einer der 17 Führungsmarker (Vf-Mt1g014230-001) war signifikant und die Hypothese steht, dass dieser SNP auf Chromosom III den früher berichteten QTL validiert (Af1, Chromosom III). Der An-satz mit geführten Marker war erfolgreich in einer Art, für die keine Genomsequenz verfügbar war. Angewandte markergestützte Auslese auf Ascochyta-Resistenz beruht stark auf dem Transfer von genetischen Ergebnissen zwischen verschiedenen Ackerbohnen-Populationen, was von weiterer Marker-Sättigung von QTL-führenden Chromosomenregionen abhängt. Die neuen, mutmaßlichen Resistenzloci in der Göttinger Winterackerbohnen-Population empfiehlt diese Population als mögliche Quelle für Resistenzzüchtung.
 
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