Spreading Depression induzierte Redoxveränderungen in hippokampalen Neuronen der Maus
Spreading Depression induced redox changes in mouse hippocampal neurons
von Marc André Ackermann
Datum der mündl. Prüfung:2022-08-08
Erschienen:2022-08-03
Betreuer:Prof. Dr. Michael Müller
Gutachter:Prof. Dr. Michael Müller
Gutachter:Prof. Dr. Christine Stadelmann-Nessler
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Format:PDF
Zusammenfassung
Englisch
Spreading depression (SD) is a neurological phenomenon characterized by massive neuronal and glial depolarization that slowly spreads in brain tissue at rates of several millimeters per minute. Due to the almost complete depolarization and the associated massive disruption of ionic homeostasis, the regular function of the neuronal network in the affected brain areas is severely disturbed or even completely collapsed. The occurrence of SD is closely related to pathophysiological conditions such as migraine, commotio cerebri, hypoxic or ischemic conditions in brain tissue, postictal depression, and also intracerebral or subarachnoid cerebral hemorrhage. Given the massive metabolic stress associated with the occurrence of an SD episode, it can be assumed that significant amounts of reactive oxygen species (ROS) are also produced. Increased production of ROS can disrupt the finely balanced redox equilibrium of neurons. The result of this created imbalance is the so-called oxidative stress, which can irreversibly damage macromolecules and ultimately lead to cellular degeneration. However, until now, no suitable optical measuring instruments were available to investigate ROS production during SD in detail. Therefore, a combination of electrophysiological field potential derivations with fluorescence microscopic measurements was performed for the detection of SD-induced redox changes. This was made possible by a transgenic redox indicator mouse model. These mice express the genetically encoded redox sensor roGFPc in excitatory projection neurons. Using the roGFPc sensor, real-time quantitative and cell-specific analyses of the redox status of neurons in the stratum pyramidale of the hippocampal CA1 region was actionable. The parallel measurement procedures realized reliable recording and subsequent quantification of the redox status of neurons during the onset of normoxic or even hypoxic SD. Selected pharmaceuticals and modifications of the ACSF solution were used to identify key players in ROS generation. These were designed to inhibit and thus reveal known radical producers. The negative DC potential change in SD was accompanied by marked oxidation of roGFPc for both normoxic and hypoxic SDs, indicating increased release of ROS during each type of SD. However, the SD correlated perturbation of redox equilibrium or radical formation is significantly greater for HSDs than for normoxic SDs. A possible explanation for this may be the lack of massive disturbance of cellular metabolism during normoxic SD initiation. For K+-induced SDs, there was also an abrupt oxidative shift in the redox status of neurons which was reversible. This can be explained by the self-limiting character of the potassium stimulus. For both hypoxia and FCCP-stimulated SDs, the oxidative shifts in redox equilibrium were irreversible. This was attributable to the too-slow washout of FCCP and sodium sulfite from brain tissue. When extracellular Ca2+ was removed, SD-associated oxidation of roGFPc decreased significantly. Furthermore, the series of experiments with mitochondrial uncoupling identified mitochondria as one of the major players of SD-induced ROS generation. However, neither mitochondrial uncoupling nor pharmacological inhibition of NADPH oxidase or xanthine oxidase alone could completely abolish roGFPc sensor oxidation. In conclusion, a key role of intracellular Ca2+ concentration, for SD associated forced ROS production, can be assumed. Furthermore, an involvement of mitochondrial and also extramitochondrial ROS sources can be assumed in principle. In summary, the measurement methodology established in the context of this work on the technical basis of the transgenic redox indicator mouse provides an innovative basis for deciphering the very subcellular mechanisms of SD induced ROS generation. This will improve the understanding of physiological and pathophysiological consequences resulting from SD episodes of any genesis.
Keywords: Spreading Depression; redox changes; neuronal depolarization; brain tissue; ionic homeostasis; SD; ROS; reactive oxygen species; roGFPc; hippocampal neurons; oxidation; hypoxia; HSD; Ca2+; stroke; migraine; redox-indicator mice
Deutsch
Spreading Depression (SD) ist ein neurologisches Phänomen, das durch eine massive neuronale und gliale Depolarisation gekennzeichnet ist, die sich im Hirngewebe langsam mit Geschwindigkeiten von einigen Millimetern pro Minute ausbreitet. Aufgrund der nahezu vollständigen Depolarisation und der damit verbundenen massiven Störung der ionalen Homöostase ist die regelrechte Funktion des neuronalen Netzes in den betroffenen Hirnarealen stark gestört oder sogar vollständig zusammengebrochen. Das Auftreten von SD steht in engem Zusammenhang mit pathophysiologischen Zuständen wie Migräne, Commotio cerebri, hypoxischen bzw. ischämischen Zuständen im Hirngewebe, postiktaler Depression und auch intrazerebralen oder subarachnoidalen Hirnblutungen. Angesichts der massiven Stoffwechselbelastung, die mit dem Auftreten einer SD-Episode einhergeht, kann davon ausgegangen werden, dass auch erhebliche Mengen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt werden. Eine vermehrte Produktion von ROS kann das fein austarierte Redoxequilibrium der Neurone stören. Das Resultat dieses entstandenen Ungleichgewichts ist sogenannter oxidativer Stress, der Makromoleküle irreversibel schädigen und in letzter Instanz zur zellulären Degeneration führen kann. Bisher standen jedoch keine geeigneten optischen Messinstrumente zur Verfügung, um die ROS Produktion während einer SD im Detail zu untersuchen. Deshalb wurde für die Detektierung SD induzierter Redoxveränderungen eine Kombination elektrophysiologischer Feldpotenzialableitungen mit fluoreszenzmikroskopischen Messungen durchgeführt. Ermöglicht wurde dies durch ein transgenes Redoxindikator-Mausmodell. Diese Mäuse exprimieren in exzitatorischen Projektionsneuronen den genetisch codierten Redoxsensor roGFPc. Mit Hilfe des roGFPc-Sensors konnten in Echtzeit ablaufende quantitative und zellspezifische Analysen des Redoxstatus der Neurone im Stratum pyramidale der CA1 Region des Hippokampus durchgeführt werden. Die parallel geschalteten Messverfahren realisierten eine zuverlässige Aufzeichnung und anschließende Quantifizierung des Redoxstatus der Neurone während des Auftretens einer normoxischen oder auch hypoxischen SD. Zur Identifizierung wesentlicher Akteure der ROS Generierung kamen ausgewählte Pharmaka und Modifikationen der ACSF-Lösung zum Einsatz. Diese sollten bekannte Radikalproduzenten inhibieren und damit aufdecken. Die negative DC-Potenzialänderung der SD war sowohl für normoxische als auch für hypoxische SDs von einer deutlichen Oxidation des roGFPc begleitet und weist damit auf eine erhöhte Freisetzung von ROS während jeder Art von SD hin. Allerdings ist die SD korrelierte Störung des Redoxgleichgewichtes bzw. die Radikalbildung für HSDs signifikant stärker als für normoxische SDs. Eine mögliche Erklärung hierfür kann die fehlende massive Störung des Zellstoffwechsels während einer normoxischen SD-Auslösung sein. Für die K+-induzierten SDs zeigte sich ebenfalls eine schlagartige oxidative Verschiebung des Redoxstatus der Neurone, die reversibel war. Dies lässt sich mit dem selbstlimitierenden Charakter des Kaliumstimulus erklären. Sowohl für die Hypoxie als auch für die FCCP stimulierten SDs waren die oxidativen Verschiebungen des Redoxequilibriums irreversibel. Zurückzuführen war dies auf das zu langsame Auswaschen von FCCP und Natriumsulfit aus dem Hirngewebe. Wurde das extrazelluläre Ca2+ entfernt, verringerte sich die SD assoziierte Oxidation von roGFPc maßgeblich. Ferner konnten die Versuchsreihen mit mitochondrialer Entkopplung die Mitochondrien als einen der Hauptakteure der SD induzierten ROS Generierung identifizieren. Allerdings konnten weder mitochondriale Entkopplung noch die pharmakologische Inhibition der NADPH-Oxidase oder Xanthin-Oxidase allein die Oxidation des roGFPc-Sensors in Gänze aufheben. Schlussfolgernd kann eine Schlüsselrolle der intrazellulären Ca2+-Konzentration, für die SD assoziiert forcierte ROS Produktion, angenommen werden. Außerdem kann grundsätzlich von einer Involvierung mitochondrialer und auch extramitochondrialer ROS-Quellen ausgegangen werden. Zusammenfassend bildet die im Kontext dieser Arbeit etablierte Messmethodik auf der technischen Basis der transgenen Redoxindikatormaus eine innovative Grundlage zur Entschlüsselung der subzellulären Mechanismen SD assoziierter ROS Generierung. Dies wird das Verständnis physiologischer und pathophysiologischer Konsequenzen, die aus SD-Episoden jeglicher Genese resultieren, verbessern.
Schlagwörter: Spreading Depression; Redoxveränderungen; Hirngewebe; ionale Homöostase; SD; ROS; Reaktive Sauerstoffspezies; roGFPc; hippokampale Neurone; Oxidation; Hypoxie; HSD; Ca2+; Schlaganfall; Migräne; neuronale Depolarisation; Redoxindikator-Maus