Charakterisierung der Oligodendroglia in akuten und chronischen Entmarkungsläsionen der Maus

Characterization of oligodendroglia in acute and chronic demyelinated lesions in the mouse

by Nadine Katharina Theresia Seitz
Doctoral thesis
Date of Examination:2022-10-10
Date of issue:2022-09-05
Advisor:Prof. Dr. Christine Stadelmann-Nessler
Referee:Prof. Dr. Christine Stadelmann-Nessler
Referee:Prof. Dr. Francesca Odoardi
Referee:PD Dr. Sabine Sennhenn-Kirchner
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9431

 

 

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Name:Dissertation Nadine Seitz Stand 16.07.21 ohn...pdf
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Format:PDF

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Abstract

English

MS is a chronic inflammatory autoimmune disease of the CNS of unknown etiology associated with demyelinating lesions. In addition to chronic demyelinated lesions, there are also remyelinated areas in the CNS. Therapeutically, promoting this remyelination process is an important approach to mitigate or counteract long-term damage after relapses. Animal models can be used to elucidate certain mechanisms of MS. To study remyelination acute demyelinating animal models are largely used, in which remyelination is often very efficient. However, there is a lack of chronic models, which are important to better understand chronic MS lesions or to test remyelination-promoting or axon-protective therapies. To develop such a chronic model, we used a spontaneous double-transgenic mouse model of EAE. It is based on crossing single-transgenic mice with MOG-specific T cells and MOG antibodies. Approximately 50% of the mice spontaneously developed EAE at the age of four to eight weeks, and after disease onset they were examined at various time points. Examination after two to six days was used to assess the acute stage of disease, and examination after one, three, six, and nine months was used to assess the chronic stage of disease. After that I used histological and immunohistochemical staining to examine the demyelinating lesions within the white matter of the spinal cord. In this work, the lesion development of acute and chronic EAE lesions was analyzed. For this purpose, I determined the size of the demyelinated lesions using LFB-PAS staining. It was found that the demyelinated areas were largest in the acute stage and with increasing disease duration there was a continuous reduction in lesion extent. To determine the density of mature oligodendrocytes and their progenitor cells in the lesions, I used the markers NogoA and Olig2. When considering the acute stage, I found a loss of mature NogoA-positive oligodendrocytes. The late chronic stages were characterized by a very low density of oligodendrocytes as well as their progenitor cells. This may indicate that chronic EAE lesions no longer remyelinate. Furthermore, I examined the inflammatory activity of the lesions to find clues for possible repeated demyelination in chronic lesions. In the acute stage, I observed a high density of freshly infiltrated S100A9-positive macrophages/monocytes and foamy-cell Mac3-positive macrophages/activated microglia with phagocytosed MBP. However, the late chronic lesions showed hardly any S100A9-positive cells and phagocytosing macrophages/activated microglia. To detect possible axonal loss, I also determined axonal density using the staining Bielschowsky. In the acute stage, axonal density was decreased compared with controls. As the disease progressed, there was a further decrease in axonal density within the lesions. Inactive MS lesions are also characterized by hypocellularity, like that of oligodendroglia and macrophages/microglia, and by reduction in axon density. In conclusion, there is much to be said for an atrophy of large areas of chronic EAE lesions. However, with the methods used here, I cannot confidently rule out remyelination of small lesions or areas of lesions, particularly at their lesion margin. Further studies are needed to conclusively clarify the extent of possible remyelination during the course of EAE. Overall, the spontaneous double-transgenic mouse model of EAE offers itself as an experimental tool to study the progression from active lesions to chronic lesions and to test possible remyelination-promoting or axon-protective substances in this context.
Keywords: axon; MS; oligodendroglia; remyelination; lesion; white matter; double-transgenic mouse model; spontaneous EAE

German

MS ist eine chronisch entzündliche Autoimmunerkrankung des ZNS unbekannter Ätiologie, die mit Entmarkungsläsionen einhergeht. Neben den chronisch entmarkten Läsionen gibt es im ZNS auch remyelinisierte Areale. Diesen Remyelinisierungsprozess zu fördern, ist therapeutisch ein wichtiger Ansatz, um langfristige Schäden nach Schüben abzuschwächen bzw. ihnen entgegenzuwirken. Mit Hilfe von Tiermodellen lassen sich bestimmte Mechanismen der MS erschließen. Auch für die Untersuchung der Remyelinisierung werden dabei größtenteils akute demyelinisierende Tiermodelle verwendet, in denen die Remyelinisierung häufig sehr effizient ist. Es gibt jedoch einen Mangel an chronischen Modellen, welche wichtig sind, um chronische MS-Läsionen besser zu verstehen oder remyelinisierungsfördernde bzw. axonprotektive Therapien zu testen. Um solch ein chronisches Modell zu entwickeln, verwendeten wir ein spontanes doppelt-transgenes Mausmodell der EAE. Es beruht auf der Kreuzung einzeltransgener Mäuse mit MOG spezifischen T-Zellen und MOG-Antikörpern. Die Mäuse, welche zu etwa 50% im Alter von vier bis acht Wochen eine spontane EAE entwickelten, wurden nach Ausbruch der Krankheit zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht. Die Untersuchung nach zwei bis sechs Tagen diente der Beurteilung des akuten Krankheitsstadiums und die Untersuchung nach ein, drei, sechs und neun Monaten der des chronischen Krankheitsstadiums. Mit Hilfe histologischer und immunhistochemischer Färbungen untersuchte ich anschließend die Entmarkungsläsionen innerhalb der weißen Substanz des Rückenmarks. In dieser Arbeit wurde die Läsionsentwicklung akuter und chronischer EAE-Läsionen analysiert. Hierzu ermittelte ich mit Hilfe der LFB-PAS-Färbung die Größe der entmarkten Läsionen. Es zeigte sich, dass die entmarkten Areale im akuten Stadium am großflächigsten waren und es mit zunehmender Krankheitsdauer zu einer kontinuierlichen Reduktion des Läsionsausmaßes kam. Um die Dichte der reifen Oligodendrozyten und ihrer Vorläuferzellen in den Läsionen zu bestimmen, verwendete ich die Marker NogoA und Olig2. Bei Betrachtung des akuten Stadiums stellte ich einen Verlust von reifen NogoA-positiven Oligodendrozyten fest. Die späten chronischen Stadien waren durch eine sehr geringe Dichte der Oligodendrozyten sowie deren Vorläuferzellen charakterisiert, was darauf hindeuten könnte, dass chronische EAE-Läsionen nicht mehr remyelinisieren. Des Weiteren untersuchte ich die entzündliche Aktivität der Läsionen, um Hinweise auf eine mögliche wiederholte Entmarkung in chronischen Läsionen zu finden. Im akuten Stadium beobachtete ich eine hohe Dichte an frisch eingewanderten S100A9-positiven Makrophagen/Monozyten und schaumzelligen Mac3-positiven Makrophagen/aktivierten Mikroglia mit phagozytiertem MBP. Die späten chronischen Läsionen zeigten jedoch kaum S100A9-positive Zellen und phagozytierende Makrophagen/aktivierte Mikroglia. Um einen möglichen axonalen Verlust zu detektieren, ermittelte ich außerdem die axonale Dichte mit Hilfe der Bielschowsky-Versilberung. Im akuten Stadium war die Axondichte im Vergleich zur Kontrolle erniedrigt. Weiterhin kam es im Krankheitsverlauf zur weiteren Abnahme der Axondichte innerhalb der Läsionen. Auch inaktive MS-Läsionen sind durch eine Hypozellularität, wie die der Oligodendroglia und der Makrophagen/Mikroglia, sowie eine Reduktion der Axondichte gekennzeichnet. Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass vieles für eine Atrophie großer Teile der chronischen EAE-Läsionen spricht. Jedoch kann ich eine Remyelinisierung kleiner Läsionen oder Teile der Läsionen, insbesondere am Läsionsrand, mit den hier verwendeten Methoden nicht sicher ausschließen. Weitere Studien sind erforderlich, um den Umfang einer möglichen Remyelinisierung im Verlauf der EAE abschließend zu klären. Insgesamt bietet sich das spontane doppelt-transgene Mausmodell der EAE als experimentelles Hilfsmittel an, um die Entwicklung von aktiven Läsionen hin zu chronischen Läsionen zu untersuchen und in diesem Zusammenhang mögliche remyelinisierungsfördernde bzw. axonprotektive Substanzen zu testen.