The role of the ROBO 3 signaling pathway in pancreatic cancer plasticity

by Niklas Krebs
Doctoral thesis
Date of Examination:2022-09-08
Date of issue:2022-09-06
Advisor:Prof. Dr. Volker Ellenrieder
Referee:Prof. Dr. Volker Ellenrieder
Referee:Prof. Dr. Michael Zeisberg
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9412

 

 

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Abstract

English

Pancreatic ductal adenocarcinoma remains one of the most aggressive cancers with a 5-year survival rate below 10 %. Particularly, the clinical outcome of metastatic pancreatic cancer is extremely poor with a dismal 5-year survival rate below 3 %. Several factors influence the high therapy resistance. The tumor microenvironment is one of them, which exhibits a complex and heterogeneous structure within the neoplastic-epithelium and stromal cells compartments, making treatment strategies extremely challenging in pancreatic cancer patients. Whole-exome sequencing and transcriptional profiling in tumor biopsies identified distinct molecular subtypes of pancreatic cancer, which correspond with prognosis and therapeutic outcome of patients. In particularly, the ‘basal-like’ subtype is substantially linked to EMT, high rates of metastasis and a therapy resistance phenotype, thus leading to a poor prognosis. Whereas the ‘classical’ subtype is markedly associated with a better therapy responsiveness leading to a preferable prognostic outcome in pancreatic cancer patients. In this study, we demonstrate that axon-guidance receptor ‘ROBO3’ promotes poorly differentiated and met-astatic basal-like phenotypes both in vitro and in vivo pancreatic cancer models. We identified that ROBO3 promotes tumor invasiveness and therapy resistance of basal-like pancreatic cancer cells. Notably, our CRISPR/dCas9-mediated ROBO3 inactivation confirmed its role in the orthotopic pancreatic mouse model. We show that ROBO3 activates STAT3 by phosphorylation at tyrosine-705 in an IL-6 independent mechanisms. Importantly, the IL-6/STAT3 regulatory mechanisms has already been identified as key event in the pre-metastatic niche formation in pancreatic cancer. We found that exogenous IL-6 induces ROBO3 and pSTAT3 expressions. However, ROBO3 silencing restricts IL-6 mediated STAT3 activation in basal-like cells. Mechanistically, ROBO3 directly controls receptor tyrosine kinase family member AXL, which in turn activates STAT3 in basal-like cells. Thus, ROBO3 or AXL depletion led to reduced invasiveness and improve chemo-responsiveness in basal-like cells. Furthermore, pharmacological inhibition of STAT3 or AXL substantially improves chemo-responsiveness towards gemcitabine in pancreatic cancer cells. Together, this study indicates that targeting ROBO3-mediated regulatory network may restore favorable outcome in a defined subgroup of pancreatic cancer patients.
Keywords: PDAC; Axon Guidance; ROBO3; Inflammation; AXL; Interleukine 6

German

Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse ist nach wie vor eine der aggressivsten Krebsentitäten mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von unter 10%. Insbesondere das klinische Behandlungsergebnis von metastasiertem Bauchspeicheldrüsenkrebs ist ausgesprochen schlecht mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von unter 3%. Ein wichtiger Faktor der sowohl die Prognose als auch die Behandlung von Patienten mit Pankreaskarzinom zu einer großen Herausforderung macht ist Tumormikroumgebung, welche eine komplexe Heterogenität innerhalb des neoplastischen Epithel- und Stromazellenkompartiments aufweist. Studien der letzten Jahre, welche die Sequenzierung des Exoms und transkriptionelle Analysen von hu-manen Tumorbiopsien beinhalten, konnten verschiedene molekulare Subtypen identifizier-ten. Diese Subtypen unterschieden sich auch weitgehend in dem therapeutischen Anspre-chen und folglich in der Prognose der Patienten. Insbesondere der "basal-like"-Subtyp zeigt einen metastatischen und therapieresistenten Phänotyp und weist daher eine schlechte Prog-nose auf. Während der "classical"-Subtyp durch seine besseres Therapieansprechen mit einer günstigeren Prognose bei Patienten assoziiert ist. In dieser Studie konnten wir nachweisen, dass der Axonsteuerungs-Rezeptor „ROBO3“ den schlecht differenzierten und metastati-schen basal-like-Phänotyp, sowohl in vitro als auch in vivo Pankreaskarzinom-Modellen fördert. Wir konnten feststellen, dass ROBO3 die Tumor Invasivität und Therapieresistenz von basal-like-Pankreaskarzinomzellen verstärkt. Insbesondere führte die CRISPR/dCas9-ver-mittelte ROBO3-Inaktivierung zu einer Reduzierung der Bildung von malignem Aszites und der Lebermetastasierung von basal-like Tumoren im orthotopen Pankreas-Mausmodell. Wir demonstrieren, dass ROBO3 in einem IL-6-unabhängigen Mechanismus STAT3 durch Phosphorylierung am Tyrosin-705 aktiviert. Die IL-6/STAT3-Regulationsmechanismen sind als Schlüsselereignis bei der prä-metastatischen Nischenbildung im Pankreaskarzinom identifiziert worden. Wir fanden heraus, dass exogenes IL-6 die Expression von ROBO3 und pSTAT3 induziert, jedoch schränkt die Inaktivierung von ROBO3 die IL-6-vermittelte STAT3-Aktivierung in basal-like Tumorzellen ein. Mechanistisch kontrolliert ROBO3 direkt das Rezeptortyrosinkinase-Familienmitglied AXL, das wiederum STAT3 in den basal-like Tumorzellen aktiviert. Insbesondere führte die Depletion von ROBO3 oder AXL zu einer reduzierten Invasivität und einer verbesserten Chemotherapie-Responsivität in Basal-like Tumorzellen. Darüber hinaus verbessert die pharmakologische Hemmung von STAT3 (durch Napabucasin) oder AXL (durch BGB324) die Chemotherapie-Responsivität von Gemcitabin in Pankreaskarzinomzellen erheblich. Die Unterbrechung der hierarchischen regulatorischen ROBO3-AXL-STAT3-Achse ermöglicht daher eine Wiederherstellung der vorteilhaften Subtypidentität bei Pankreaskarzinom. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die Beeinflussung des ROBO3-vermittelten regulatorischen Netzwerks bei einer defi-nierten Untergruppe von Pankreaskarzinom-Patienten ein positives Therapieergebnis wie-derherstellen könnte.
 
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