Kardiale Effekte der m6A-Methylierung auf micro-RNA-Bindung

Wery von Limont, Nelly Leonore

dc.contributor.advisor	Toischer, Karl Prof. Dr.
dc.contributor.author	Wery von Limont, Nelly Leonore
dc.date.accessioned	2022-09-12T06:22:24Z
dc.date.available	2022-09-21T00:50:13Z
dc.date.issued	2022-09-12
dc.identifier.uri	http://resolver.sub.uni-goettingen.de/purl?ediss-11858/14238
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9441
dc.language.iso	deu	de
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
dc.subject.ddc	610	de
dc.title	Kardiale Effekte der m6A-Methylierung auf micro-RNA-Bindung	de
dc.type	doctoralThesis	de
dc.title.translated	Cardiac effects of m6A-methylation on micro-RNA-binding	de
dc.contributor.referee	Toischer, Karl Prof. Dr.
dc.date.examination	2022-09-14	de
dc.description.abstractger	Die Herzinsuffizienz ist ein häufig vorkommendes Krankheitsbild und von bedeutender klinischer Relevanz. Durch eine vermehrte Belastung des Herzens vergrößern sich die Kardiomyozyten, wodurch das Herz hypertrophiert. Hinzu kommen Veränderungen der Genexpression und das kardiale Remodeling. Die kardiale Pumpfunktion wird dadurch stark reduziert und es treten klinische Symptome wie Leistungsminderung und Belastungsdyspnoe auf. Die aktuellen Behandlungsansätze basieren vor allem auf einer Hemmung der neuroendokrinen und intrazellulären Signalwege, die zum kardialen Remodeling beitragen. Ihre Effizienz ist aber limitiert. Durch intensive Forschung in den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass die m6A-Methylierung der RNA bei der Herzinsuffizienz eine wichtige Rolle spielen könnte. Insbesondere die miRNAs nehmen durch ihre regulatorische Funktion auf die Genexpression einen großen Stellenwert ein. Sie beeinflussen fast alle biologischen Prozesse auf posttranskriptionaler Ebene. Bei der Herzhypertrophie sind viele miRNAs differentiell exprimiert und beeinflussen die Entstehung und das Fortschreiten durch eine pro- oder antihypertrophe Aktivität. Über die genauen Funktionen und Einflüsse der m6A-Methylierung und ihrer Regulatoren FTO und METTL3 in der Herzhypertrophie und -insuffizienz ist bisher aber noch wenig bekannt. Gleiches gilt in diesem Zusammenhang für die Rolle von miRNAs, welche ebenfalls m6A-methyliert werden können. Ein Zellkulturmodell aus hiPSC-Kardiomyozyten (hiPSC-CM) unter Stimulation von pharmakologischen Agenzien stellt eine geeignete Möglichkeit zur Untersuchung und Identifikation neuer Mechanismen dar, die am kardialen Remodeling beteiligt sind. Erstes Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Validierung eines solchen Modells zur Simulation von Stress bzw. Hypertrophie in hiPSC-CM. Zur Simulation von Stress in den hiPSC-CM erwies sich eine sechsstündige Behandlung mit Isoprenaline (ISO) 100 nm bzw. Phenylephrine (PE) 100 μm als geeignet. Die Induktion von Hypertrophie in den hiPSC-CM konnte durch eine Behandlung mit Endothelin-1 (ET-1) in der Konzentration 3 nm über 48 Stunden erreicht werden. Hierrunter kam es in den hiPSC-CM zu einer signifikanten Zunahme der Zellgröße und Erhöhung etablierter Hypertrophiemarker (Nppb, ACTA1) verglichen mit der Kontrollgruppe. Anschließend folgte die Untersuchung zur Charakterisierung des generellen miRNA-Profils und dessen Methylierungsveränderungen in der Herzhypertrophie. Hierfür wurde das vorher etablierte in vitro Hypertrophiemodell mit ET-1 verwendet. Zunächst wurde aus den gewonnenen Proben die RNA isoliert, fraktioniert und eine methylated RNA immunoprecipitation sequencing (meRip-Seq) durchgeführt. Hierfür wurde die kurze RNA-Fraktion genutzt, die die miRNAs enthält. Die Datentransformation und statistische Analyse wurde vom Deutschen Zentrum für neurodegenerative Erkrankungen (DZNE) durchgeführt. Insgesamt konnten im Vergleich zwischen den mit ET-1 behandelten hiPSC-CM und den Kontrollen 558 differentiell exprimierte miRNAs identifiziert werden. Davon waren 292 herunterreguliert und 266 hochreguliert. Signifikant hochregulierte miRNAs waren die hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-129-5p, hsa-miR- 132-3p und SNORD38A-201. Die miRNAs hsa-miR-19a, hsa-let-7e-5p, hsa-miR- 405-5p, hsa-miR-133b und hsa-miR19b-3p hingegen zeigten eine signifikant verminderte Expression. Die in dieser Arbeit gefundenen signifikant differentiell exprimierten miRNAs zeigen ein hohes Maß an Übereinstimmung bezüglich ihrer Hoch- bzw. Herunterregulation mit anderen Hypertrophiemodellen. Es konnten vielversprechende miRNAs identifiziert werden, die über unterschiedliche Ziele und Signalwege die Hypertrophie beeinflussen. Die miRNAs selber können auch m6a-methyliert sein, wobei der Effekt dieser Methylierung noch weitestgehend unbekannt ist. Mithilfe einer Methylierungsanalyse konnte gezeigt, dass unter ET-1 Behandlung mehr miRNAs in ihrer Methylierung verändert waren als in ihrer Expression. Hiervon wiesen die drei miRNAs hsa-miR-1180-3p, hsa-miR-664-5p und hsa-miR-315-5p eine signifikante Methylierung in den ET-1 behandelten hiPSC-CM auf, aber keine veränderte Expression. Dies deutet auf eine Endothelin spezifische Veränderung der Methylierung hin. Bei Herzversagen nimmt die Expression von FTO ab und die m6A-Methylierung zu, was zu einer Reduktion der kardialen Kontraktilität beiträgt. Diese neueren Erkenntnisse zeigen, dass FTO eine bedeutende Stellung in der Entwicklung einer Herzinsuffizienz einnimmt. Zur weiteren Untersuchung der Rolle von FTO bei der Herzinsuffizienz wurde in dieser Arbeit die Verwendung des Zellkulturmodells zur Manipulation des Methylierungsapparates untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von FTO sich mithilfe von einer siRNA in den hiPSC-CM transient unterdrücken lässt. Die siRNA wurde mithilfe von Lipotransfektion erfolgreich in die hiPSC-CM eingebracht. Nach Austestung verschiedene potenzieller Kandidaten erwies sich die siRNA 5 als geeignet für eine Herunterregulation von FTO in den hiPSC-CM. In einem nächsten Schritt kann dieses FTO-Knock-Down-Modell mit dem in vitro Hypertrophie-Modell kombiniert werden, um den Einfluss von FTO auf die Hypertrophie genauer zu untersuchen.	de
dc.description.abstracteng	Heart failure is a common syndrome and of huge medial relevance. Increased stress levels lead to an enlargement of cardiomyocytes and the heart becomes hypertrophic. This is accompanied by changes in gene expression and cardiac remodeling. The pump function of the heart gets reduced and clinical symptoms like reduced performance and shortness of breath appear. Current treatment approaches are mainly based on the inhibition of neuroendocrine and intracellular signaling pathways which contribute to the cardiac remodeling. But their efficiency is limited. Intensive research over the last years showed that m6A-methylation of RNA could play an important role in heart failure. Especially miRNAs with its regulatory functions could be an important factor. miRNAs influence nearly all biological processes. Within the context of heart failure many miRNAs are differentially expressed and affect the development and progression by pro- or anti-hypertrophic activities. Up to now not much is known about the precise function and impact of m6A-methylation and its regulators METTL3 and FTO in heart hypertrophy and failure. The same is true for the role of miRNAs which also can be m6a-methylated. A cell culture model composed of hiPSC-cardiomyocytes (hiPSC-CM) undergoing stimulation with pharmacological agents is an appropriate method to investigate and identify new mechanisms which contribute to cardiac remodeling. One aim of this work was the establishment and validation of such a model to simulate stress or hypertrophy in hiPSC-CM. To simulate stress in the hiPSC-CM a six-hour treatment with isoprenaline (ISO) 100 nm or phenylephrine (PE) 100 μm turned out to be suitable. The induction of hypertrophy in hiPSC-CM was achieved by a treatment with endothelin-1 (ET-1) in the concentration of 3 nm over 48 hours. Thus, resulted in a significant increase of cell size and established hypertrophy markers (Nppb, ACTA1) in hiPSC-CM in comparison to the control group. This was followed by the study on the characterization of the general miRNA profile and its changes in methylation in heart hypertrophy. Therefore, the previously established in vitro hypertrophy model with ET-1 was used. First, RNA was isolated from the prepared samples, then fractionated and a methylated RNA immunoprecipitation sequencing (meRIP-Seq) was performed. For this only the short RNA-fraction was used, which contains the miRNA. Data transformation and statistic analysis was performed by the Deutschen Zentrum für neurodegenerative Erkrankungen (DZNE). All in all, 558 differently expressed miRNAs were identified in comparison between ET-1 treated hiPSC-CM and controls. Thereof, 266 miRNAs were up- and 292 downregulated. Following miRNAs showed a significant upregulation: hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-129-5p, hsa-miR- 132-3p and SNORD38A-201. Whereas hsa-miR-19a, hsa-let-7e-5p, hsa-miR- 405-5p, hsa-miR-133b und hsa-miR19b-3p showed a decreased expression. The significant differentially expressed miRNAs found in this work display a high degree of consensus regarding their up- and downregulation with other hypertrophy models. Promising miRNAs could be identified, which have an influence on hypertrophy via different targets and signaling pathways. miRNAs itself can also be m6A-methylated, whereas the effect of this methylation is quite unknown yet. A methylation analysis revealed that more miRNAs are altered in methylation than in expression under ET-1 treatment. Thereof, three miRNAs (hsa-miR-1180-3p, hsa-miR-664-5p and hsa-miR-315-5p) showed a significant methylation undergoing ET-1 treatment in hiPSC-CM but no change in expression. This suggests an endothelin specific modification of the methylation. Heart failure is accompanied by a decreased expression of FTO and an increased m6a-methylation. This leads to a reduction of cardiac contractility. These more recent findings show, that FTO plays an important role in the development of heart failure. To study the role of FTO in heart failure, the possibility of using the cell culture model to manipulate the methylation machinery was examined. The study has shown that the expression of FTO could be transient suppressed by siRNA in hiPSC-CM. siRNA was successfully installed in hiPSC-CM via lipotransfection. After testing several potential candidate’s siRNA 5 proved to be suitable for downregulation of FTO in hiPSC-CM. Next step is to combine this FTO-knock-down-model with the in vitro hypertrophy model to investigate the effect of FTO on hypertrophy more closely.	de
dc.contributor.coReferee	Fischer, André Prof. Dr.
dc.contributor.thirdReferee	Schön, Margarete Prof. Dr.
dc.subject.ger	mircoRNA	de
dc.subject.ger	m6a-Methylierung	de
dc.subject.ger	Herzinsuffizienz	de
dc.subject.ger	kardiales Remodeling	de
dc.subject.ger	FTO	de
dc.subject.ger	Epigenetik	de
dc.subject.ger	Hypertrophie	de
dc.subject.ger	miRNA	de
dc.subject.eng	microRNA	de
dc.subject.eng	m6A-methylation	de
dc.subject.eng	heart failure	de
dc.subject.eng	cardiac remodeling	de
dc.subject.eng	FTO	de
dc.subject.eng	epigenetic	de
dc.subject.eng	hypertrophy	de
dc.subject.eng	miRNA	de
dc.identifier.urn	urn:nbn:de:gbv:7-ediss-14238-9
dc.affiliation.institute	Medizinische Fakultät	de
dc.subject.gokfull	OK-MEDIZIN	de
dc.subject.gokfull	Innere Medizin - Allgemein- und Gesamtdarstellungen (PPN619875747)	de
dc.description.embargoed	2022-09-21	de
dc.identifier.ppn	1818710056
dc.notes.confirmationsent	Confirmation sent 2022-09-12T06:45:01	de

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Human- und Zahnmedizin [2871]

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