Nanoskalauntersuchungen vom zellulären Metabolismus mittels Sekundärionen-Massenspektrometrie

by Lena Karsten
Doctoral thesis
Date of Examination:2022-12-05
Date of issue:2022-11-15
Advisor:Prof. Dr. Silvio O. Rizzoli
Referee:Prof. Dr. Silvio O. Rizzoli
Referee:Prof. Dr. Henning Urlaub
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9484

 

 

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Abstract

English

Alzheimer is the most neurodegenerative disease. Hallmark of Alzheimer’s disease ist he pathological accumulation of the proteins Aβ and Tau. The aggregates of these accumulation are called Aβ-plaques and neurofibrillary tangles. The metabolism of the aggregates is discussed controversially - if the Aβ-plaques and neurofibrillary tangles show a structural stability or if they are in dynamic equilibrium with their environment. Moreover, some studies suggest that the aggregation is promoted by an hyperphosphorylation of Aβ and Tau. Therefore two transgenic mice 5xFAD and P301L were choosed for investigation. 5xFAD has five familial mutations and forms Aβ-plaques, P301L forms neurofibrillary tangles.The 27 weeks old mice were fed with 13C-Lysin enriched food for three weeks. Three weeks later, the mice were perfused, sections of brain were made and the sections were stained with antibodies against Aβ (6E10) or Tau (PHF-1). Subsequently, the sections were embedded in LR- White and microtome sections were made. Two fluorescence pictures and seven NanoSIMS pictures were compiled by one preparation. Four areas -aggregates, non-aggregates, unspecific signal and background- were defined with the fluorescence picture. NanoSIMS was used for the isotopical investigation of these areas. Therefore the ratios 13C14N/12C14N, 31P/12C14N and 31P/32S were determined and analysed statistically. Moreover, the areas aggregate, non-aggregate and unspecific signal were investigated from center to periphery with linescans. The aggregates in both mice showed significantly the lowest grade of 13C incorporation. Furthermore, the periphery of aggregates shows a significant higher grade of incorporation. Therefore, the aggregates show a stability in center and a dynamic in periphery. This is why they can called metastabile. The investigation of phosphorylation exhibits that the aggregates are not hyperphosphorylated but maybe the hyperphosphorylation is more important in sporadic alzheimer with late onset.
Keywords: alzheimer

German

Alzheimer ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung, von der weltweit 50 Millionen Menschen betroffen sind. Hauptmerkmale sind das sich progredient verschlechternde klinische Erscheinungsbild und die pathologische Akkumulation von den Proteinen Aβ und Tau. Die aggregierten Proteinakkumulationen werden als Aβ-Plaques und Tau-Neurofibrillen bezeichnet. Der Metabolismus dieser Aggregate wird kontrovers diskutiert. Es ist bisher nicht vollständig geklärt, ob die Aβ-Plaques und Tau-Neurofibrillen eine strukturelle Stabilität aufweisen oder sich durch ständige Umbauprozesse in einem dynamischen Gleichgewicht mit ihrer Umgebung befinden. Außerdem wird vermutet, dass die Aggregation durch eine erhöhte Phosphorylierung der Aβ- und Tau-Proteine gefördert wird und deswegen hyperphosphorylierte Aggregate entstehen. Ziel dieser Arbeit ist es, den Metabolismus der Aggregate und ihren Phosphoreinbau zu untersuchen. Hierbei wurde die isotopische Zusammensetzung der Plaques und ihrer Umgebung mithilfe der Nanoskala-Sekundärionen-Massenspektrometrie (NanoSIMS) analysiert. Für die Untersuchung wurden die transgenen Mäuselinien 5xFAD und Tau-P301L ausgewählt. Die 5xFAD-Mäuselinie besitzt fünf familiäre Alzheimermutationen, die zu einer Aβ-Plaque-Bildung führen. Die Tau-P301L-Mäuselinie bildet durch die P301L-Mutation Tau-Neurofibrillen aus. Die 27 Wochen alten Mäuse wurden über drei Wochen mit 13C-Lysin reicher Nahrung gefüttert. Lysin ist eine Aminosäure, die für den Aufbau anderer Aminosäuren und somit für die Bildung neuer Proteine benötigt wird. 13C ist ein stabiles Isotop, das physiologisch zu 1,05% vorkommt. Nach den drei Wochen wurden die Mäuse mit Paraformaldehyd perfundiert und Gehirnschnitte angefertigt. Die Gehirnschnitte wurden mit Antikörpern gegen humanes Aβ (Antikörper 6E10) bzw. gegen humanes Tau (Antikörper PHF-1) angefärbt, in LR-White eingebettet und anschließend Mikrotomschnitte angefertigt. Mit den Präparaten wurden zwei Fluoreszenzbilder und sieben NanoSIMS-Bilder erstellt. Mit den Fluoreszenzbildern konnten die vier Bereiche Aggregat, Nicht-Aggregat, unspezifisches Signal und Hintergrund definiert werden. Mit der Nano-SIMS-Technologie konnte die isotopische Zusammensetzung dieser Bereiche bestimmt werden, wodurch Rückschlüsse auf den Metabolismus gezogen wurden. Um den Einbau der Isotope in die Proteine zu analysieren, wurden die Isotopenverhältnisse 13C14N/12C14N, 31P/12C14N und 31P/32S ermittelt und statistisch untersucht. Zusätzlich wurden Linescans erstellt, die die Isotopenverhältnisse 13C14N/12C14N vom Zentrum der Aggregate, Nicht-Aggregate und unspezifischen Signale in die Peripherie zeigten. Die Aggregate wiesen sowohl in der 5xFAD als auch in der Tau-P301L-Mäuselinie einen signifikant geringeren 13C-Einbau auf als in den anderen Bereichen. Zudem zeigte sich ein signifikant höherer Einbau in der Peripherie der Aggregate im Vergleich zu dem Zentrum. Auf die Fragestellung bezogen, ob die Aβ-Plaques und Tau-Neurofibrillen eine strukturelle Stabilität aufweisen oder ständigen Umbauprozessen unterliegen, implizieren die Ergebnisse metastabile Aggregate. Im Zentrum scheint sich ein strukturell stabiler Kern zu bilden, wohingegen die Peripherie in einem Gleichgewicht mit der Umgebung steht und eine Dynamik zeigt. Die zweite Vermutung, dass hyperphosphorylierte Aggregate entstehen, kann nicht bestätigt werden. Die Tau-P301L-Mäuse zeigen sogar eine geringere Phosphorylierung. In den 5xFAD-Mäusen zeigt sich lediglich ein tendenziell höherer Phosphoreinbau in die Aggregate im Vergleich zu den anderen Bereichen. Daher scheint die Aggregation eher das Resultat der Proteinüberexpression zu sein. Dennoch ist ein aggregationsförderndes Potenzial der Phosphorylierung bei einer langsameren Aggregatbildung und einem späteren Beginn der Alzheimer nicht auszuschließen.
 
Statistik