Development of attract and kill formulations for biological psyllid pest control

by Linda Claire Muskat
Doctoral thesis
Date of Examination:2022-10-28
Date of issue:2022-12-06
Advisor:Prof. Dr. Michael Rostás
Referee:Prof. Dr. Michael Rostás
Referee:Prof. Dr. Anant Patel
Referee:Prof. Dr. Travis Glare
Sponsor:Federal Ministry of Food and Agriculture (BMEL)
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9590

 

 

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Description:Dissertation

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Abstract

English

Psyllid pests are distributed all over the world causing damage in various crop plants by serving as vector insects for phytoplasmosis diseases. One of these psyllids distributed in Europe is Cacopsylla picta (Hemiptera: Psyllidae), which is the only known vector of Candidatus Phytoplasma mali, the causing agent of apple proliferation. There are no direct measures to combat phytoplasmosis bacteria, thus, the vector itself needs to be controlled. As chemical insecticides have been increasingly restricted in recent years due to their high risk to non-target organisms, new strategies for psyllid control are needed. Innovative attract-and-kill strategies using semiochemicals and beneficial microorganisms offer insect-specific and environmentally friendly control options. One of the potential allomones released by apple trees attractive towards Cacopsylla picta is β-caryophyllene. Due to the instability against UV and oxidation and their high volatility, protection and release control of semiochemicals by formulation is needed. Entomopathogenic fungi are considered as promising alternative to common synthetic insecticides. In 2016, the new entomophthoralean fungus Pandora sp. nov. inedit. (ARSEF 13372) was isolated from a Cacopsylla sp. collected in a Danish pear orchard. Species of the Entomophthorales are known for their strict host specificity, their fast speed-to-kill and for their ability to cause epizootics. To enable commercial applicability of Pandora sp. nov., the non-economic mass production and inconsistent efficiency after field application needs to be overcome. The overall aim of this work was the development of innovative formulations that can be applied in attract-and-kill-strategies for the biological control of Cacopsylla picta in apple orchards. Special emphasize was laid on the development of a slow release formulation for the attractant β-caryophyllene and the establishment of a fermentation and formulation process suitable for mass production and propagation of the entomopathogenic fungus Pandora sp. nov. inedit. (ARSEF 13372) in psyllid pest control. Chapter 1 provides important background information and the state-of-the-art of the research topics addressed in this thesis. In addition, this chapter contains a review providing an overview of recent formulations developed for insect behavior manipulation by semiochemicals, focusing on formulation aspects and the potential for slow and controlled release. This chapter also covers the state-of-the-art on entomophthoralean fungi as biocontrol agents and on attract-and-kill strategies. In Chapter 2, a novel formulation based on an ethylcellulose-candelilla wax-oleogel was developed for the slow release of β-caryophyllene as attract formulation for C. picta. The developed and patented formulation combines unique properties that makes it highly suitable for semiochemical formulation and release, such as a reduced processing temperature, improved oil-binding capacity and mechanical stability, self-adhesive properties on leaves and release modifiability. Chapter 3 deals with the potential of the attract formulation developed in Chapter 2 for a controlled release. β-caryophyllene release was found to be affected by melting of candelilla wax as a thermo-responsive oleogelator. Thus, the novel ethylcellulose-candelilla wax-oleogel formulation bears the potential for a temperature-triggered release of β-caryophyllene. With the formulation presented in Chapter 2 and 3, a novel matrix-type semiochemical formulation based on nontoxic, biobased and biodegradable materials is provided that will contribute to the establishment of oleogels as delivery systems for semiochemicals in general. In Chapter 4, the biomass production of the new entomophthoralean psyllid-pathogenic fungus Pandora sp. nov. inedit (ARSEF 13372) in a liquid culture was explored. Pandora sp. nov. was found to grow best in media containing skimmed milk, but even faster in a mixture of skimmed milk, yeast extract and a low-cost protein hydrolysate from animal by-products. Increased media osmolality through the addition of sodium chloride promoted growth as finely dispersed mycelium, which is suitable for subsequent encapsulation in hydrogel beads. After the medium had been transferred to a stirred tank bioreactor with a working volume of 8 L, a maximum biomass dry weight of 21 g/L was reached after 48 hours. These promising results pave the way for large-scale fermentation processes of the new Pandora species. In Chapter 5, Pandora sp. nov. inedit. (ARSEF 13372) was converted into an easily applicable form by encapsulation in Ca-alginate beads. Pandora sp. nov. grew from the beads and discharged conidia over 12 days. Supplementing the beads with skimmed milk as nutrient source increased conidial numbers by 2.95-fold. Beads containing skimmed milk as nutritional additive and 10% Pandora sp. nov. biomass led to the highest mortalities of 48.3% and 75.0% in the two target psyllid species Cacopsylla picta and Cacopsylla pyri, respectively. In a second bioassay, the survival time of Cacopsylla pyri was significantly reduced when exposed to beads containing 20% Pandora sp. nov with a median survival time of 5–6 days past inoculation and a cumulative mortality of 89%. The promising results of this study will ease the way for large-scale field application of the new Pandora species in biological psyllid pest control. Chapter 6 addresses the high humidity requirements necessary for successful sporulation of entomophthoralean fungi. Pandora sp. nov. was found to sporulate only when the water activity was higher than 0.99. Co-application with a paste-type formulation based on biopolymers with high water sorption capacities developed and patented in this work allowed encapsulated Pandora sp. nov. to sporulate under very dry humidity conditions of 30 – 40% RH in the laboratory for at least 6 days and even under dry conditions in a semi-field trial during summertime. In Chapter 7, a computer-assisted image analysis method was developed for the rapid, simple and objective quantification of actively discharged conidia of Pandora sp. nov. The key to faster quantification is the calculation of the linear relationship between the gray value and the automatically counted number of conidia, which needs to be performed only once in the beginning of the analysis. Afterwards, the gray value is used as single parameter for quantification. The method can be performed with conventional laboratory equipment by using bright-field microscopes, standard scanners and the open-source software ImageJ and, thus, can serve as a manual for other researchers for quantification of fungal spores. In Chapter 8 the findings of this work are summarized and discussed, the impact is pointed out and prospects for future research and developments are given.
Keywords: Oleogel; Encapsulation; Entomopathogenic fungi; Entomophthorales; Biological control; Attract and kill; Cacopsylla spp.; Semiochemical release; Pandora cacopsyllae; Biopesticide formulation; Fermentation; Bioinsecticide

German

Psylliden sind weltweit verbreitet und verursachen durch ihre Rolle als Vektorinsekten für Phytoplasmen Schäden in verschiedenen Kulturpflanzen. Ein in Europa verbreiteter Psyllide ist Cacopsylla picta (Hemiptera: Psyllidae), der einzige bekannte Vektor von Candidatus Phytoplasma mali, dem Erreger der Apfeltriebsucht. Es gibt derzeit keine Mittel um Phytoplasmen direkt in der Pflanze zu bekämpfen, daher bleibt als einzige Möglichkeit die Bekämpfung des Vektorinsekts, um eine Infektion zu vermeiden. Da der Einsatz chemischer Insektizide aufgrund ihres hohen Risikos für Nichtzielorganismen zunehmend eingeschränkt wird, steigt die Nachfrage nach neuen Strategien zur Psyllidenbekämpfung. Innovative attract-and-kill-Strategien, in denen verhaltenmanipulierende Semiochemikalien und insektenpathogene Mikroorganismen kombiniert werden, bieten insektenspezifische und umweltfreundliche Bekämpfungsmöglichkeiten. Eines der Allomone, die von Apfelbäumen freigesetzt werden und attraktiv auf C. picta wirken, ist β-Caryophyllen. Aufgrund ihrer Instabilität gegenüber UV-Strahlung und Oxidation sowie ihrer hohen Flüchtigkeit ist ein Schutz und eine Freisetzungskontrolle von Semiochemikalien wie dem β-Caryophyllen durch Formulierung erforderlich. Entomopathogene Pilze gelten als vielversprechende Alternative zu herkömmlichen synthetischen Insektiziden. Im Jahr 2016 wurde der entomopathogene Pilz Pandora sp. nov. inedit. (ARSEF 13372) (Entomophthorales) aus einer in einer dänischen Birnenanlage gesammelten Cacopsylla sp. isoliert. Pilze der Entomophthorales sind für ihre hohe Wirtsspezifität, ihre schnelle Abtötungsgeschwindigkeit und ihre Fähigkeit, Epizootien auszulösen, bekannt. Um die kommerzielle Anwendbarkeit von Pandora sp. nov. inedit. zu ermöglichen, müssen die unwirtschaftliche Massenproduktion und die schwankende Effizienz nach der Feldanwendung überwunden werden. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung innovativer Formulierungen, die in attract-and-kill-Strategien zur biologischen Bekämpfung von C. picta in Apfelanlagen eingesetzt werden können. Besonderes Augenmerk wurde auf die Entwicklung einer Formulierung zur verlangsamten Freisetzung des Lockstoffs β-Caryophyllen und auf die Etablierung eines Fermentations- und Formulierungsprozesses gelegt, der sich für die Massenproduktion und Ausbringung des entomopathogenen Pilzes Pandora sp. nov. inedit. (ARSEF 13372) eignet. Kapitel 1 liefert wichtige Hintergrundinformationen und den aktuellen Stand der Technik der in dieser Arbeit behandelten Forschungsthemen. Darüber hinaus enthält dieses Kapitel einen Überblick über Formulierungen, die zur Verhaltensmanipulation von Insekten durch Semiochemikalien entwickelt wurden, wobei der Schwerpunkt auf Formulierungsaspekten und dem Potenzial für eine langsame und kontrollierte Freisetzung liegt. In diesem Kapitel wird auch der aktuelle Stand der Forschung zu Pilzen der Entomophthorales als Biocontrol Agents und zu attract-and-kill-Strategien behandelt. In Kapitel 2 wurde eine neuartige Formulierung auf Basis eines Ethylcellulose-Candelillawachs-Oleogels für die verlangsamte Freisetzung von β-Caryophyllen als Lockstoff für C. picta entwickelt. Die entwickelte und patentierte Formulierung kombiniert einzigartige Eigenschaften, die sie für die Formulierung und Freisetzung von Semiochemikalien äußerst geeignet macht, darunter eine reduzierte Verarbeitungstemperatur, eine verbesserte Ölbindekapazität und mechanische Stabilität, selbsthaftende Eigenschaften auf Blättern und Modifizierbarkeit der Semiochemikalienfreisetzung. Kapitel 3 befasst sich mit dem Potenzial der in Kapitel 2 entwickelten Lockstoffformulierung für eine kontrollierte Freisetzung. Es wurde festgestellt, dass die Freisetzung von β-Caryophyllen durch das Schmelzen von Candelillawachs als thermoresponsivem Oleogelator beeinflusst wird. Somit birgt die neuartige Formulierung das Potenzial für eine temperaturgesteuerte Freisetzung von β-Caryophyllen. Mit der in Kapitel 2 und 3 entwickelten Formulierung wird eine neuartige Semiochemikalienformulierung bestehend aus ungiftigen, biobasierenden und biologisch abbaubaren Materialien bereitgestellt, die zur Etablierung von Oleogelen als univereselle Freisetzungssysteme für Semiochemikalien beitragen wird. In Kapitel 4 wurde die Biomasseproduktion des neuen psyllidenpathogenen Pilzes Pandora sp. nov. inedit (ARSEF 13372) in Flüssigkultur untersucht. Pandora sp. nov. wuchs am besten in Medien, die Magermilch enthielten, aber noch schneller in einer Mischung aus Magermilch, Hefeextrakt und einem kostengünstigen Proteinhydrolysat aus tierischen Schlachtereiabfällen. Die Erhöhung der Osmolalität des Mediums durch die Zugabe von Natriumchlorid förderte das Wachstum des Pilzes in Form von fein-dispergiertem Myzel, das sich für die anschließende Verkapselung in Hydrogelkapseln eignet. Nachdem das Medium in einen Rührkessel-Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 8 L überführt worden war, wurde nach 48 Stunden ein maximales Biomasse-Trockengewicht von 21 g/L erreicht. Diese vielversprechenden Ergebnisse ebnen den Weg für großtechnische Fermentationsprozesse der neuen Pandoraart. In Kapitel 5 wurde Pandora sp. nov. inedit. (ARSEF 13372) durch Verkapselung in Ca-Alginat in eine leicht anwendbare Form überführt. Pandora sp. nov. wuchs aus den Kapseln aus und gab über 12 Tage Konidien ab. Der Zusatz von Magermilch als Nährstoffquelle erhöhte die Konidienzahl um das 2,95-Fache. Kapseln, die Magermilch als Nährstoffzusatz und 10% Pandora sp. nov.-Biomasse enthielten, führten zu den höchsten Mortalitätsraten von 48,3 % bzw. 75,0 % in den beiden Zielinsekten Cacopsylla picta und C. pyri. In einem zweiten Infektionsversuch wurde C. pyri Kapseln mit einer Biomassebeladung von 20% ausgesetzt, was zu einer signifikant reduzierten mittleren Überlebenszeit von 5 – 6 Tagen und einer Mortalität von 89% führte. Die vielversprechenden Ergebnisse dieser Studie stellen die großflächige Feldanwendung der neuen Pandora-Art in der biologischen Schädlingsbekämpfung in Aussicht. Kapitel 6 befasst sich mit den Anforderungen der Entomophthorales an eine hohe Luftfeuchtigkeit, die für eine erfolgreiche Sporulation erfolderlich ist. Es wurde festgestellt, dass Pandora sp. nov. nur dann sporuliert, wenn die Wasseraktivität höher als 0,99 ist. Die Co-Applikation der Pandora-Formulierung aus Kapitel 5 mit einer pastenartigen Formulierung auf Basis von Biopolymeren mit hoher Wasseraufnahmekapazität, die in dieser Arbeit entwickelt und patentiert wurde, ermöglichte die Sporulation von verkapseltem Pandora sp. nov. unter sehr trockenen Feuchtebedingungen von 30 - 40 % RH im Laborversuch für mindestens 6 Tage und sogar unter trockenen sommerlichen Bedingungen in einem Halbfreilandversuch. In Kapitel 7 wurde eine computergestützte Bildanalysemethode für die schnelle, einfache und objektive Quantifizierung von aktiv ausgeschiedenen Konidien von Pandora sp. nov. entwickelt. Der Schlüssel zur schnelleren Quantifizierung liegt in der Berechnung der linearen Beziehung zwischen dem Grauwert und der automatisch gezählten Anzahl der Konidien, die nur einmal zu Beginn der Analyse durchgeführt werden muss. Anschließend wird der Grauwert als einziges Parameter für die Quantifizierung verwendet. Die Methode kann mit herkömmlicher Laborausrüstung unter Verwendung von Hellfeldmikroskopen, Standardscannern und der Open-Source-Software ImageJ durchgeführt werden, sodas sie anderen Forschern als Anleitung zur Quantifizierung von Pilzsporen dienen kann. In Kapitel 8 werden die Ergebnisse dieser Arbeit zusammengefasst und diskutiert, die Highlights aufgezeigt und Empfehlungen für künftige Forschungsthemen und Entwicklungen gegeben.
 
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