Templat-vermittelte Synthese zyklischer Peptide an programmierten Coiled-Coil-Gerüsten
Template-mediated synthesis of cyclic peptides on programmed Coiled-Coil scaffolds
by Wolf Mathis Rink
Date of Examination:2022-02-24
Date of issue:2022-12-12
Advisor:Prof. Dr. Franziska Thomas
Referee:Prof. Dr. Franziska Thomas
Referee:Prof. Dr. Claudia Steinem
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Name:Dissertation_WMRink.pdf
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Format:PDF
Abstract
English
In recent years, macrocyclic peptides have experienced a renaissance in research. Due to their restricted conformation, they have a high substrate specificity and, relative to their size, a large surface area. This is reflected in their high efficiency to target protein-protein interactions (PPI). As biopharmaceuticals such as antibiotics, they are characterized by their increased stability and low immunogenicity. Targeted chemical modifications allow cyclic peptides to cross the blood-brain barrier and penetrate cell membranes. Macrocyclization of short peptides with less than seven amino acid residues is difficult due to increasing ring tension. In addition, alternative syntheses in numerous cases employ orthogonal protecting group strategies, thus lowering solubility. The aim of this work was to develop a template-mediated peptide cyclization using the parallel heterodimeric coiled coil. This scaffold allows modular functionalization of the two peptide strands. For this purpose, the cyclization target should be attached as a C-terminal peptide thioester with an alkyne-modified amino acid side chain to an azide-functionalized coil strand using the CuAAC reaction. The association of a complementary thiol-modified coil strand is intended to create spatial proximity between the reactive groups of the peptide termini via an intermediately formed hairpin structure. This pre-organization then enables a rapid reaction through head-to-tail macrocyclization. The optimized CuAAC reaction protocol showed proportional formylation of an N-terminal cysteine peptide thioester to the corresponding thiazolidine. Mechanistic considerations and control experiments identified tert-butanol as the formyl source. By fine-tuning the ratio of copper to Cu(I)-stabilizing ligand, suitable and robust conditions were identified for coil peptide decoration with N-cysteine peptide thioesters as cyclization targets. In addition to direct aminolysis, native chemical ligation (NCL) was investigated as a macrocyclization reaction. Coiled-coil-mediated aminolysis of a heptapeptide thioester showed the formation of very stable hairpin structures under neutral conditions. Subsequently, the use of imidazole in PBS buffer at pH 9 led to cyclization, but an undesired side chain-to-tail macrocycle was obtained as the most probable major product. By replacing the N-terminal amino acid with cysteine, cyclization via native chemical ligation was investigated for hepta-, hexa-, penta-, and tetrapeptides. Cyclization of the hepta- to pentapeptides was rapid in both the coiled-coil-mediated reaction and the background reaction. Only the tetrapeptide with a C-terminal glycine was successfully cyclized from the hairpin structure. The two tetrapeptides with sterically more demanding C-terminal amino acids alanine and serine led to the formation of hairpin structures that cyclized more slowly than the non-template-mediated reaction, requiring a systematic consideration of the orientation of the hairpin structure. It was shown that by binding the to be cyclized peptides to coil peptides, rapid and successful cyclization of hepta- to pentapeptides was possible. In the future, these can be used to build up cyclopeptide libraries on coiled-coil scaffolds and to develop binding assays.
Keywords: coiled coil; template; macrocyclization; CuAAC; peptide thioester; direct aminolysis; native chemical ligation
German
In den letzten Jahren kam es in der Forschung zu einer Renaissance makrozyklischer Peptide. Aufgrund der eingeschränkten Konformation besitzen sie eine hohe Substratspezifität und weisen, gemessen an ihrer Größe, eine große Oberfläche auf. Dies zeigt sich in ihrer hohen Effizienz Protein-Protein-Interaktionen (PPI) gezielt beeinflussen zu können. Als Biopharmazeutika, wie Antibiotika, zeichnen sie sich durch ihre erhöhte Stabilität und niedrige Immunogenität aus. Über gezielte chemische Modifikationen können zyklische Peptide die Blut-Hirn-Schranke überwinden und Zellmembranen durchdringen. Die Makrozyklisierung von kurzen Peptiden mit weniger als sieben Aminosäureresten ist aufgrund der steigenden Ringspannung schwierig. Darüber hinaus nutzen alternative Synthesewege vielfach die Verwendung von orthogonalen Schutzgruppenstrategien und senken so die Löslichkeit. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Templat-vermittelten Peptidzyklisierung unter Verwendung des parallelen heterodimeren Coiled-Coils. Dieses Gerüst erlaubt die modulare Funktionalisierung der beiden Peptidstränge. Dazu sollte das Zyklisierungsziel als C-terminaler Peptidthioester mit einer Alkin-modifizierten Aminosäureseitenkette über die CuAAC-Reaktion mit einem Azid-funktionalisierten Coil-Trägerstrang verbunden werden. Durch Assoziation eines komplementären Thiol-modifizierten Coil-Strangs sollte über eine intermediär gebildete Haarnadelstruktur eine räumliche Nähe zwischen den reaktiven Gruppen der Peptid-Termini geschaffen werden. Diese Vororganisation erlaubt dann eine schnelle Abreaktion über eine Kopf-zu-Schwanz-Makrozyklisierung. Das optimierte CuAAC-Reaktionsprotokoll zeigte anteilige Formylierung eines N-terminalen Cysteinpeptidthioesters zum entsprechenden Thiazolidin. Durch mechanistische Überlegungen und Kontrollexperimente konnte tert-Butanol als Formylquelle identifiziert werden. Über die Feinjustierung des Verhältnisses von Kupfer zu Cu(I)-stabilisierenden Ligand konnten geeignete und robuste Bedingungen für die Coil-Peptiddekoration mit N-Cysteinpeptidthioestern als Zyklisierungsziel gefunden werden. Als Makrozyklisierungsreaktionen wurde neben der direkten Aminolyse auch die Native Chemische Ligation (NCL) untersucht. Die Coiled-Coil-vermittelte Aminolyse eines Heptapeptidthioesters zeigte die Bildung sehr stabiler Haarnadelstrukturen unter neutralen Bedingungen. Die Verwendung von Imidazol in PBS-Puffer bei pH 9 führte anschließend zu einer Zyklisierung, wobei jedoch ein unerwünschter side chain-to-tail-Makrozyklus als wahrscheinliches Hauptprodukt erhalten wurde. Durch Austausch der N-terminalen Aminosäure mit Cystein wurde die Zyklisierung über eine Native Chemische Ligation für Hepta-, Hexa-, Penta- und Tetrapeptide untersucht. Die Zyklisierung der Hepta- bis Pentapeptide erfolgte dabei sowohl für die Coiled-Coil-vermittelte Reaktion als auch die Hintergrundreaktion schnell. Nur für das Tetrapeptid mit einem C-terminalen Glycin konnte eine erfolgreiche Zyklisierung aus der Haarnadelstruktur nachgewiesen werden. Die zwei Tetrapeptide mit sterisch anspruchsvolleren C-terminalen Aminosäuren Alanin und Serin führten zur Bildung von Haarnadelstrukturen, die langsamer als die nicht Templat-vermittelte Reaktion zyklisierten und eine systematische Betrachtung der Orientierung der Haarnadelstruktur nötig machen. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Bindung der zu zyklisierenden Peptide an Coil-Peptide eine zügige und erfolgreiche Zyklisierung von Hepta- bis Pentapeptiden möglich war. Diese können zukünftig für den Aufbau von Cyclopeptidbibliotheken an Coiled-Coil-Gerüsten und zur Entwicklung von Bindungsassays genutzt werden.
Schlagwörter: Coiled-Coil; Templat; Makrozyklisierung; CuAAC; Peptidthioester; direkte Aminolyse; Native Chemische Ligation