| dc.contributor.advisor | Braus, Gerhard Prof. Dr. | |
| dc.contributor.author | Bakti, Fruzsina Erzsébet | |
| dc.date.accessioned | 2022-12-20T17:07:40Z | |
| dc.date.available | 2022-12-27T00:50:09Z | |
| dc.date.issued | 2022-12-20 | |
| dc.identifier.uri | http://resolver.sub.uni-goettingen.de/purl?ediss-11858/14429 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9637 | |
| dc.format.extent | 169 Seiten | de |
| dc.language.iso | eng | de |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ | |
| dc.subject.ddc | 572 | de |
| dc.title | Assembly pathway of the fungal COP9 signalosome | de |
| dc.type | doctoralThesis | de |
| dc.contributor.referee | Heimel, Kai Prof. Dr. | |
| dc.date.examination | 2022-02-28 | de |
| dc.description.abstractger | Das COP9 Signalosom (CSN Komplex) ist ein Proteinkomplex aus acht Untereinheiten,
der in höheren Eukaryoten konserviert ist und für die multizelluläre Entwicklung benötigt wird.
CSN kontrolliert den Austausch von Substrat-Rezeptoren von E3 Ubiquitin-Cullin-RING
Ligasen und damit die Spezifität des Protein-Abbaus in eukaryotischen Zellen. Beim Aufbau
des CSN Holokomplexes des filamentösen Pilzes Aspergillus nidulans wird im letzten Schritt
die katalytische CsnE Deneddylase-Untereinheit in einen sieben-Untereinheiten Prä-CSN
Komplex eingebaut. Hauptziel der Doktorarbeit war die in vivo Identifikation der zellulären
Schritte, die für den Zusammenbau des Gesamtkomplexes aus den einzelnen CSN-
Untereinheiten notwendig sind. Dafür wurden genetischen und biochemischen Methoden
kombiniert. Alle CSN Untereinheiten werden für die sexuelle Entwicklung und den dazu
gehörenden Sekundärmetabolismus benötigt. Daneben können einzelne Untereinheiten des
Prä-CSN Komplexes das Wachstum der Kolonie und die asexuelle Entwicklung unterstützen.
Entsprechende funktionelle GFP-CSN Fusionsproteine, die alle diese Phänotypen
komplementieren können, wurden für GFP-Affinitätsanreicherungen und anschließende
Massen-Spektrometrie in unterschiedlichen csn-Mutanten verwendet. Ein Hauptergebnis
dieser Interaktom-Analyse war die Entdeckung von zwei heterotrimer Subkomplexen als
Zwischenstufe für den Aufbau des CSN Komplexes. Diese beiden Trimere, CsnA-CsnC-CsnH
und CsnD-CsnF-CsnG, werden unabhängig von CsnB gebildet. CsnE ist nicht in der Lage mit
einem der beiden Trimere zu interagieren, wenn CsnB in der Zelle fehlt. CsnB ist daher
notwendig, um die beiden Trimere zum Prä-CSN Komplex zu verbinden und damit die
Inkorporation von CsnE als finalem Schritt der Komplexbildung zu ermöglichen. Die zellulären
Proteinmengen für die einzelnen CSN Untereinheiten werden durch unterschiedliche
Feedback-Mechanismen kontrolliert. Die Wild-Typ-Menge an CsnA Protein wird nur dann in
der Zelle erreicht, wenn ausreichend Proteine für die anderen Untereinheiten der beiden
Trimere vorhanden sind. CsnA wird andererseits benötigt, um ausreichende Mengen des
Brücken-Proteins CsnB zu bekommen. Die Menge an CsnD, das ein Teil des CsnD-CsnF-
CsnG Trimers darstellt, wird umgekehrt erhöht, wenn ausreichende Mengen anderer
Untereinheiten des Prä-CSN Komplexes fehlen. Diese Ergebnisse weisen auf ein komplexes
zelluläres Überwachungssystem, das die Proteinmengen für die beiden Trimere, für das
Brückenprotein CsnB und die Deneddylase CsnE, und damit den akkuraten Aufbau des
gesamten CSN Komplexes kontrolliert. Ein weiteres Kontrollsystem steuert die zelluläre
Lokalisierung der CSN Untereinheiten. Der stabile acht-Untereinheiten CSN Holokomplex ist
überwiegend im Zellkern lokalisiert. Der CsnD-CsnF-CsnG Subkomplex befindet sich auch
vorwiegend im Nukleus, während das CsnA-CsnC-CsnH Trimer zwischen Zytoplasma und
Zellkern verteilt ist. Die Anreicherung des Brückenproteins CsnB im Zellkern erfordert CsnA,
aber nicht die CsnE Deneddylase. Vermutlich wird CsnB daher mit CsnA oder mit dem CsnA-
CsnC-CsnH Trimer in den Kern transportiert. Insgesamt ergab die hier durchgeführte Analyse,
dass der zelluläre Aufbau des COP9 Signalosoms bei A. nidulans über die Bildung zweier
Trimere führt, die durch CsnB verknüpft werden. Dies ermöglicht dann die Inkorporation der
CsnE Deneddylase als einziger Untereinheit des CSN Holokomplexes mit intrinsischer
Enzymaktivität. Der Aufbauprozess erfordert ein vielfältiges Zusammenspiel zwischen
wechselseitiger Kontrolle der Proteinmengen der Untereinheiten, deren korrekter zellulärer
Lokalisierung und ihres sequentiellen Zusammenbaus. | de |
| dc.description.abstracteng | The conserved eight-subunit COP9 signalosome (CSN complex) controls the exchange
of E3 ubiquitin cullin RING ligase receptors, and therefore the specificity of protein degradation
in eukaryotic cells and it is required for multicellular development. The CSN complex of the
filamentous fungus Aspergillus nidulans assembles through a seven-subunit pre-CSN
complex, which is activated by the final integration of the catalytic CsnE deneddylase, thereby
forming an eight-subunit CSN, as in humans. The goal of this work was to identify the
assembly pathway of fungal pre-CSN complex in vivo by combined genetic and biochemical
approaches. Loss of CsnE and the abolishment of the pre-CSN complex formation result in
distinct fungal phenotypes. All fungal COP9 signalosome subunits are required for sexual
development and secondary metabolism. Subunits of the pre-CSN complex additionally
support wild type-like growth and asexual development. Functional GFP-CSN subunit fusions
can complement the corresponding phenotypes. GFP-CSN subunit-based GFP-affinity
enrichments combined with mass spectrometry allowed the identification of interacting CSN
subcomplexes. The interactome analysis revealed, as one major result, that two distinct
heterotrimeric CSN subcomplexes are intermediates of the assembly pathway. These
heterotrimers, CsnA-CsnC-CsnH and CsnD-CsnF-CsnG, are formed independently of CsnB.
CsnE cannot associate to either any of the heterotrimers or CSN subunits without CsnB, which
supports that this subunit acts as link between the two trimeric subcomplexes. Subtle cellular
feedback surveillance mechanisms control that equal CSN subunit amounts are available for
CSN assembly. Accordingly, loss of csn subunit genes differentially changes protein levels of
remaining CSN subunits. Subunits of both heterotrimeric subcomplexes are required to reach
wild type-like CsnA protein amounts, which is part of the CsnA-CsnC-CsnH subcomplex. In
contrast, relative protein levels of CsnD, which is part of the CsnD-CsnF-CsnG trimer, are
increased, if the pre-CSN complex cannot be formed. CsnG is a prerequisite to connect
subunits of the CsnD-CsnF-CsnG subcomplex and it is part of the surveillance for the cellular
CsnD amounts. Furthermore, CsnA and, therefore the CsnA-CsnC-CsnH trimer, is required
for appropriate CsnB amounts, because the inability to form CsnA-CsnC-CsnH reduces
relative levels of the CsnB bridging protein. These results support a complex orchestration for
providing sufficient levels of subunits for the correct CSN assembly pathway, which includes
a mutual control of the formation of both trimers. In addition, the cellular abundance of the
CsnE deneddylase and the CsnB linker are adjusted independently of each other. An
additional level of control includes the cellular localization of CSN subunits. The stable
octameric CSN complex is enriched in nuclei, whereas CSN subassemblies inhabit different
cellular compartments. The CsnD-CsnF-CsnG trimer is predominantly nuclear localized,
whereas CsnA-CsnC-CsnH is evenly distributed between nuclei and cytoplasm. Nuclear
enrichment of the linker CsnB is independent of the deneddylase subunit, but depends on
CsnA and, therefore, an intact CsnA-CsnC-CsnH trimer. This suggests that CsnB is
transported into the nuclei together with CsnA. In summary, the fungal COP9 signalosome is
assembled through two trimeric subcomplexes linked by CsnB, which enables final
association with the CsnE deneddylase. Formation of the functional CSN complex requires a
sophisticated interplay between mutual control of subunit protein levels, correct localization
and sequential assembly. | de |
| dc.contributor.coReferee | Ficner, Ralf Prof. Dr. | |
| dc.subject.eng | COP9 signalosome, CSN complex, pre-CSN complex, native CSN subcomplexes, assembly, affinity purification, subcellular localization, Aspergillus nidulans | de |
| dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-ediss-14429-3 | |
| dc.affiliation.institute | Göttinger Zentrum für molekulare Biowissenschaften (GZMB) | de |
| dc.subject.gokfull | Molekularbiologie, Gentechnologie (PPN619462973) | de |
| dc.description.embargoed | 2022-12-27 | de |
| dc.identifier.ppn | 1828182958 | |
| dc.notes.confirmationsent | Confirmation sent 2022-12-21T06:15:02 | de |