Characterization of the Complexin - SNARE Protein Network in Different Synaptic Systems

von Jutta Meyer
Dissertation
Datum der mündl. Prüfung:2022-05-02
Erschienen:2023-01-24
Betreuer:Prof. Dr. Nils Brose
Gutachter:Prof. Dr. Nils Brose
Gutachter:Prof. Dr. Tiago Fleming Outeiro
Zum Verlinken/Zitieren: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9687

 

 

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Zusammenfassung

Englisch

At neuronal synapses, the exocytotic SNARE complex is formed by Syntaxin 1, SNAP25 and Synaptobrevin 2. Complexin (Cplx) regulates the SNARE function to achieve the high speed and spatial precision of synaptic vesicle fusion. All four known mammalian Cplxs share a short central α helix, which was shown to be necessary for SNARE complex binding of Cplx1. The high degree of conservation in this central domain suggests that probably all Cplxs exert their function via an interaction with SNARE complexes, raising the question whether different Cplxs act upon different SNARE complex types. Peptides representing this domain bind to reconstituted SNARE complexes with submicromolar affinities in vitro. An affinity purification approach was developed with short synthetic peptides covering the central α-helical SNARE-binding domain of Cplxs1 to 4. After incubation of the immobilized Cplx peptides with detergent extracts of mouse cortex or retina, multiple Cplx-binding proteins were detected using a quantitative mass spectrometry approach. The detailed analysis of these proteins shows that basically there are differences in the Cplx interactomes. In the cortex samples, a variety of possible regulators and effectors were identified, among them different members of the of SNARE protein family including Syntaxin 1, SNAP25 and Synaptobrevin 2. Moreover, the samples also contained the complete set of SNAREs which are known to form complexes of the endosomal and lysosomal pathway, respectively. Surprisingly, these SNARE proteins were found to be Cplx isoform independent. A co-enrichment with neuronal SNARE proteins was excluded by repeating the affinity purification approach with HEK cells, which do not contain neuronal SNARE proteins. A functional effect of Cplx on non-exocytotic pathways was shown with a transferrin uptake assay. Cplx1 and Cplx2 are expressed in conventional synapses of almost all neuron types of the brain, while Cplx3 and Cplx4 are preferentially expressed in ribbon synapses of retinal photoreceptors and bipolar cells. The different distribution pattern of the two Cplx subgroups raises the question whether Cplx3 and 4 contribute to the highly specialized mode of neurotransmitter release found in ribbon synapses. Therefore, analysis of proteins which were detected in the course of experiments using retina material was rather directed to the extended interaction network. Interestingly, RIBEYE and some Transducin subunits were identified as specific interactors of Cplx3 and 4. The results of this work suggest that Cplx may be involved in processes beyond the regulation of synaptic exocytosis.
Keywords: Neurobiology; SNARE proteins; Complexin; Endocytosis; Cortex; Retina

Deutsch

In neuronalen Synapsen wird der exozytotische SNARE-Komplex aus Syntaxin 1, SNAP25 und Synaptobrevin 2 gebildet. Complexin (Cplx) reguliert die SNARE Funktion, was zum Erreichen einer hohen Geschwindigkeit und räumlichen Präzision der synaptischen Vesikelfusion beiträgt. Ein gemeinsames Merkmal der vier, bei Säugetieren beschriebenen Cplx ist die zentrale α-Helix, die essenziell für die SNARE-Komplexbindung von Cplx1 ist. Der hohe Konservierungsgrad dieser Domäne deutet darauf hin, dass alle Cplx ihre Funktion über eine Interaktion mit SNARE-Komplexen ausüben, was die Frage aufwirft, ob verschiedene Cplx mit verschiedenen SNARE-Komplex-Typen interagieren. Cplx-Peptide, die diese Domäne repräsentieren, binden mit submikromolaren Affinitäten an in vitro rekonstituierte SNARE-Komplexe. Diese Eigenschaft wurde zur Entwicklung eines Affinitätsreinigungsverfahren verwendet: kurze synthetischen Peptide, die die zentrale SNARE-Bindungsdomäne von Cplxs1 bis 4 abdecken, wurden immobilisiert und mit Detergenzextrakten aus Mäusekortex oder -retina inkubiert. Die so angereicherten Cplx-bindenden Proteine wurden durch quantitative Massenspektrometrie analysiert. Die Auswertung der gesammelten Daten zeigte, dass es grundsätzlich Unterschiede in den Cplx-Interaktomen gibt. In den Cortex-Proben wurde eine Vielzahl möglicher Regulatoren und Effektoren identifiziert, darunter verschiedene Mitglieder der SNARE-Proteinfamilie, wie Syntaxin 1, SNAP25 und Synaptobrevin 2. Darüber hinaus enthielten die Proben komplette Sets an SNARE-Proteinen, die für den endosomalen bzw. lysosomalen Signalweg von Bedeutung sind. Überraschenderweise erwiesen sich diese SNARE-Proteine als unabhängig von der Cplx-Isoform. Eine Absicherung der Ergebnisse erfolgte in vitro durch Anreicherungs-Experimente unter Verwendung von Lysaten aus HEK-Zellen, die keine neuronalen SNARE-Proteine enthalten, sowie in vivo durch Transferrin-Aufnahme. Cplx1 und Cplx2 werden in konventionellen Synapsen des zentralen Nervensystems exprimiert, während Cplx3 und Cplx4 überwiegend in den Bandsynapsen der retinalen Photorezeptoren und Bipolarzellen lokalisiert sind. Dieses unterschiedliche Verteilungsmuster wirft die Frage auf, ob Cplx3 und 4 zu der hochspezialisierten Art der Neurotransmitterfreisetzung in Bandsynapsen beitragen. Die Analyse der Proteine, die im Rahmen der Experimente mit Retina-Material nachgewiesen wurden, richtete sich daher eher auf das erweiterte Interaktionsnetzwerk. Interessanterweise wurden RIBEYE und einige Transducin-Untereinheiten als spezifische Interaktoren von Cplx3 und 4 identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass Cplx an Prozessen beteiligt sein könnte, die über die Regulierung der synaptischen Exozytose hinausgehen.
 
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