Mild production of reactive oxygen species reversibly affects the metabolism and function of the heart

by Ana Maria Vergel Leon
Doctoral thesis
Date of Examination:2022-12-20
Date of issue:2023-01-25
Advisor:Prof. Dr. Dörthe Katschinski
Referee:Prof. Dr. Stephan E. Lehnart
Referee:Prof. Dr. Sven Thoms
Referee:Prof. Dr. Thomas Meyer
Referee:PD Dr. Antje Ebert
Referee:Prof. Dr. Susanne Lutz
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9685

 

 

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Abstract

English

Reactive oxygen species (ROS) are molecular oxygen derivatives that are produced as an attribute of aerobic life. The relationship between elevated levels of ROS and heart failure (HF) has been extensively studied. However, the exact physiopathology and redox signaling pathways underlying this pathophysiological condition remain unclear. We established a genetically modified mouse model able to detect and produce hydrogen peroxide (H2O2) by combining the HyPer biosensor and the D-amino acid oxidase (DAO) enzyme. To this end, we generated HyPer-DAO mice that express the H2O2 generator/detector fusion protein with a nuclear localization signal and targeted by the αMHC promoter specifically in cardiomyocytes (CMS). Hence, the HyPer-DAO fusion protein served as the chemogenetic tool to produce and probe the presence of H2O2 in the nucleus of cardiomyocytes. Once HyPer-DAO nuclear expression and functionality were validated, morphometric analysis and echocardiographic examination excluded any type of cardiac failure specifically due to the presence of the transgene. In vivo experiments were carried out to induce H2O2 through oral administration of D-ala treatment via drinking water. These resulted in heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF) demonstrated by standard (B-mode and M-mode) and advanced (strain and strain rate) echocardiographic analysis. This effect was reversed after the cessation of treatment, which was supported by the recovery of contractile function. After treatment and subsequent H2O2 elevation, strain analysis demonstrated a myocardial ionotropic impairment during systole, whereas no changes were observed in diastole. Furthermore, the absence of fibrosis and structural changes were proven by histology and echocardiography, respectively. The observed phenotype in the mice developed under a mild increase in H2O2 production demonstrated by activation of ROS target genes exclusively sensitive to low levels of H2O2. Using simulated myocardial biomechanics, we demonstrated a decrease in isometric force after H2O2 induction upon D-ala treatment in left ventricular slides obtained from the HyPer-DAO mice. The impairment of inotropic function was reversed by prior incubation with an antioxidant agent, concluding that the changes in contractility are due to redox modifications. Redox proteomics analysis was applied to identify target proteins that were modified by H2O2. The IDH3γ protein was the redox-modified candidate that captured our attention because of its relevant role in the tricarboxylic acid (TCA) cycle. IDH3γ is the regulatory subunit of the IDH3 tetramer, which consists of two catalytically active α-subunits, one β and one γ-subunit. IDH3 activity was found to be increased after D-ala treatment and H2O2 induction in isolated cardiomyocytes and HEK cells with stable overexpression of HyPer-DAO in the nucleus. ATP Abstract 20 levels decreased after H2O2 induction in concordance with the decrease of contractility. The increase in IDH3 activity was reversed after the cessation of treatment which is consistent with the restoration of inotropic functionality observed in the transgenic mice. Our results highlight the importance of redox switch regulators such as IDH3γ, which regulate mitochondrial energy metabolism and cardiac contractility under oxidative stress.
Keywords: Reactive oxygen species (ROS); heart failure (HF); hydrogen peroxide (H2O2); D-amino acid oxidase (DAO); cardiomyocytes (CMS); echocardiography; isocitrate dehydrogenase (IDH)

German

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind molekulare Sauerstoffderivate, die als Merkmal des aeroben Lebens produziert werden. Der Zusammenhang zwischen erhöhter ROS-Konzentration und Herzinsuffizienz (HF) wurde bereits eingehend untersucht. Die genaue Physiopathologie und die Redox-Signalwege, die diesem pathophysiologischen Zustand zugrunde liegen, bleiben jedoch unklar. Durch die Kombination des HyPer-Biosensors und des Enzyms D-Aminosäure-Oxidase (DAO) haben wir ein genetisch verändertes Mausmodell entwickelt, das Wasserstoffperoxid (H2O2) nachweisen und produzieren kann. Zu diesem Zweck haben wir HyPer-DAO-Mäuse erzeugt, die das H2O2-Generator/Detektor-Fusionsprotein mit einem nuklearen Lokalisierungssignal exprimieren und durch den αMHC-Promotor speziell in Kardiomyozyten (CMS) gesteuert werden. Das HyPer-DAO-Fusionsprotein diente also als chemogenetisches Werkzeug, um H2O2 im Kern von Kardiomyozyten zu erzeugen und zu untersuchen. Nach der Validierung der HyPer-DAO-Kernexpression und -Funktionalität schlossen morphometrische Analysen und echokardiographische Untersuchungen jede Art von Herzversagen aus, das speziell auf das Vorhandensein des Transgens zurückzuführen war. In vivo wurden Experimente zur Induktion von H2O2 durch orale Verabreichung von D-Ala über das Trinkwasser durchgeführt. Dies führte zu einer Herzinsuffizienz mit verminderter Auswurffraktion (HFrEF), die durch standardmäßige (B-Mode und M-Mode) und fortgeschrittene (Dehnung und Dehnungsrate) echokardiographische Analysen nachgewiesen wurde. Dieser Effekt wurde nach Beendigung der Behandlung rückgängig gemacht, was durch die Erholung der kontraktilen Funktion unterstützt wurde. Nach der Behandlung und der anschließenden H2O2-Erhöhung zeigte die Dehnungsanalyse eine Beeinträchtigung der myokardialen Ionotropie während der Systole, wohingegen in der Diastole keine Veränderungen beobachtet wurden. Darüber hinaus wurde das Fehlen von Fibrose und strukturellen Veränderungen histologisch bzw. echokardiographisch nachgewiesen. Der beobachtete Phänotyp bei den Mäusen entwickelte sich unter einer leichten Erhöhung der H2O2-Produktion, die sich in der Aktivierung von ROS-Zielgenen zeigte, die ausschließlich auf niedrige H2O2-Konzentrationen reagieren. Unter Verwendung simulierter myokardialer Biomechanik konnten wir eine Abnahme der isometrischen Kraft nach H2O2-Induktion bei D-Ala-Behandlung in linksventrikulären Präparaten von HyPer-DAO-Mäusen nachweisen. Die Beeinträchtigung der inotropen Funktion wurde durch vorherige Inkubation mit einem Antioxidans aufgehoben, was darauf schließen lässt, dass die Veränderungen der Kontraktilität auf Redox-Modifikationen zurückzuführen sind. Zur Identifizierung von Zielproteinen, die durch H2O2 modifiziert wurden, wurde eine Redox-Proteomik-Analyse durchgeführt. Das Protein IDH3γ war der redoxmodifizierte Kandidat, der unsere Aufmerksamkeit erregte, da es eine wichtige Rolle im Tricarbonsäurezyklus (TCA) spielt. IDH3γ ist die regulatorische Untereinheit des IDH3-Tetramers, das aus zwei katalytisch aktiven α-Untereinheiten, einer β- und einer γ-Untereinheit besteht. Es wurde festgestellt, dass die IDH3-Aktivität nach D-Ala-Behandlung und H2O2-Induktion in isolierten Kardiomyozyten und HEK-Zellen mit stabiler Überexpression von HyPer-DAO im Zellkern erhöht ist. Die ATP-Abstract-20-Spiegel sanken nach H2O2-Induktion in Übereinstimmung mit der Abnahme der Kontraktilität. Der Anstieg der IDH3-Aktivität wurde nach Beendigung der Behandlung rückgängig gemacht, was mit der bei den transgenen Mäusen beobachteten Wiederherstellung der inotropen Funktion übereinstimmt. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von Redox-Switch-Regulatoren wie IDH3γ, die den mitochondrialen Energiestoffwechsel und die kardiale Kontraktilität unter oxidativem Stress regulieren.
 
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