Einfluss einer ERK1/2-Resistenz auf Zellwachstum und Invasivität von triple-negativen Mammakarzinomzellen
Influence of ERK1/2 resistance on cell growth and invasiveness of triple-negative breast cancer cells
by Judith Vera Buse
Date of Examination:2023-02-09
Date of issue:2023-01-27
Advisor:Prof. Dr. Carsten Gründker
Referee:Prof. Dr. Heidi Hahn
Referee:Prof. Dr. Thomas Meyer
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Name:Einfluss einer ERK-Resistenz auf Zellwachstu...pdf
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Format:PDF
Abstract
English
Breast cancer is the most common cancer in women. The subtype of triple-negative breast cancer (TNBC) accounts for 10-20%, for which the therapeutic options are limited. The most frequently mutated signaling pathway in human cancer cells is the mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade pathway. Many genetic mutations have been observed in breast cancer, especially around the extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) in this MAPK cascade. Due to the emergence of resistance during therapeutic inhibition of upstream kinases, research is now focused on the ERK1/2 kinase itself However, the effects of ERK1/2 resistance are not yet known and should therefore be investigated. In TNBC cells (cell lines HCC1806 and HCC70) it could be demonstrated by Western blot that the ERK1/2 inhibitor SCH772984 reduces pERK1/2 expression. But not with the ERK1/2 inhibitor ulixertinib. Despite the lack of pERK1/2 reduction, ulixertinib inhibits the phosphorylation of target substrates, which has already been described in the literature. In 3D spheroid invasion assays, both inhibitors were shown to reduce 3D spheroid invasion in TNBC cells. An ERK1/2 resistance could be generated against SCH772984 in the cell line HCC1806. It was shown by Western blotting that ERK1/2-resistant cells express pERK1/2 at a lower overall level than non-resistant cells. The fact that ERK1/2 resistance leads to increased invasiveness was shown using 3D spheroid invasion assays. However, no influence of ERK1/2 resistance on cell growth could be observed using the proliferation assay with AlamarBlue. These findings indicate that the increased 3D spheroid invasion in ERK1/2 resistance is not due to an altered proliferation rate. It has already been shown that the connective tissue growth factor (CTGF), dependent on ERK1/2 phosphorylation, is an important driver of cell invasion. Using immunofluorescence, no correlating increasing influence of ERK1/2 resistance on CTGF expression could be observed. Because immunofluorescence results are obtained from one experiment, additional experiments must be performed for significant results. The GnRH analogue triptorelin was investigated as a possible treatment option for ERK1/2 resistance using Western blot analyses, 3D spheroid invasion assays and proliferation analyses. GnRH analogues inhibit growth factor-induced activation of the ERK1/2-MAPK cascade. No significant effect of triptorelin on ERK1/2-resistant cells could be observed. In ERK1/2-resistant cells, it can be assumed that ERK1/2 is activated by crosstalk with parallel signaling pathways and feedback loops of common downstream substrates - and this independently of the inhibition of the activation of the cascade. Based on the results presented, the GnRH analogue triptorelin seems rather unsuitable as a potential drug for overcoming ERK1/2 resistance in TNBC cells. Other therapeutic options for overcoming ERK1/2 resistance, such as approaches in parallel signal cascades, should be investigated in further trials.
Keywords: TNBC; breast cancer; MAPK; ERK; resistance; invasion; HCC1806; HCC70; SCH772984; Ulixertinib
German
Das Mammakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung bei Frauen. 10 – 20 % macht der Subtyp des triple-negative breast cancer (TNBC) aus, bei dem die therapeutischen Optionen eingeschränkt sind. Der am häufigsten mutierte Signalweg in menschlichen Krebszellen ist der mitogen-activated protein kinase-(MAPK-)Kaskadeweg. Bei Brustkrebserkrankungen konnten vor allem um die extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) in dieser MAPK-Kaskade viele genetische Mutationen beobachtet werden. Aufgrund von Resistenzentstehungen bei therapeutischer Inhibition von ihr vorgeschalteten Kinasen, richtet sich das Interesse der Forschung nunmehr auf die ERK1/2-Kinase selbst. Allerdings sind Auswirkungen einer ERK1/2-Resistenz bisher nicht bekannt und sollen daher untersucht werden. In TNBC-Zellen (Zelllinie HCC1806 und HCC70) konnte mittels Western Blot nachgewiesen werden, dass durch den ERK1/2-Inhibitor SCH772984 die pERK1/2 Expression gesenkt wird. Nicht aber durch den ERK1/2-Inhibitor Ulixertinib. Trotz fehlender pERK1/2-Verminderung hemmt Ulixertinib aber die Phosphorylierung von Zielsubstraten, was bereits in der Literatur beschrieben wird. In 3D-Sphäroid-Invasionsassays konnte aufgezeigt werden, dass beide Inhibitoren die 3D-Sphäroid-Invasion in TNBC-Zellen reduzieren. Eine ERK1/2-Resistenz konnte gegenüber SCH772984 in der Zelllinie HCC1806 generiert werden. Mittels Western Blot wurde gezeigt, dass ERK1/2-resistente Zellen pERK1/2 in einem geringeren Gesamtniveau als nicht resistente Zellen exprimieren. Dass eine ERK1/2-Resistenz zu einer erhöhten Invasivität führt, wurde mithilfe von 3D-Sphäroid-Invasionsassays aufgezeigt. Allerdings konnte kein Einfluss einer ERK1/2-Resistenz auf das Zellwachstum anhand des Proliferationsassays mit AlamarBlue beobachtet werden. Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die gesteigerte 3D-Sphäroid-Invasion bei einer ERK1/2-Resistenz nicht auf einer veränderten Proliferationsrate beruht. Es wurde bereits gezeigt, dass der connective tissue growth factor (CTGF), abhängig von der ERK1/2-Phosphorylierung, einen wichtigen Treiber der Zellinvasion darstellt. Anhand einer Immunfluoreszenz konnte kein korrelierender erhöhender Einfluss einer ERK1/2-Resistenz auf die CTGF-Expression beobachtet werden. Da die Ergebnisse der Immunfluoreszenz aus einem Versuch stammen, müssen für signifikante Ergebnisse weitere Versuche erfolgen. Als mögliche Behandlungsoption bei einer ERK1/2-Resistenz wurde das GnRH-Analogon Triptorelin mittels Western Blot Analysen, 3D-Sphäroid-Invasionsassays sowie Proliferationsanalysen untersucht. GnRH-Analoga hemmen die wachstumsfaktorinduzierte Aktivierung der ERK1/2-MAPK-Kaskade. Es konnte kein signifikanter Effekt von Triptorelin auf die ERK1/2-resistenten Zellen beobachtet werden. Bei ERK1/2-resistenten Zellen ist anzunehmen, dass es durch crosstalk mit parallelen Signalwegen sowie Feedbackschleifen gemeinsamer nachgeschalteter Substrate zur Aktivierung von ERK1/2 kommt – und das unabhängig von der Inhibierung der Aktivierung der Kaskade. Aufgrund dargelegter Ergebnisse scheint das GnRH-Analogon Triptorelin als potenzielles Medikament zur Überwindung einer ERK1/2-Resistenz in TNBC-Zellen eher ungeeignet. Andere therapeutische Möglichkeiten zur Überwindung einer ERK1/2-Resistenz, wie beispielsweise Ansätze in parallelen Signalkaskaden, sollten in weiteren Versuchen untersucht werden.
Schlagwörter: Mammakarzinom; TNBC; MAPK; ERK; Resistenz; Invasion; HCC1806; HCC70; SCH772984; Ulixertinib