Anreicherung und semiautomatisierte Detektion HER2-positiver zirkulierender Tumorzellen im Mammakarzinom
Enrichment and semi-automatic detection of HER2-positive circulating tumor cells in breast cancer
von Okka Johanna Wiebke Wilken geb. Wilken
Datum der mündl. Prüfung:2023-03-28
Erschienen:2023-03-09
Betreuer:Prof. Dr. Steven Johnsen
Gutachter:Prof. Dr. Steven Johnsen
Gutachter:Prof. Dr. Elisabeth Hessmann
Gutachter:Prof. Dr. Ralf Dressel
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Format:PDF
Zusammenfassung
Englisch
In clinical practice HER2 status has so far been determined using tissue samples from biopsies. As sample collection is an invasive, time-consuming procedure for patients, the focus is nowadays on blood-based biomarkers such as circulating tumor cells (CTC) or circulating tumor DNA (ctDNA) in the context of liquid biopsy. Therefore, we analyzed the blood of patients with metastatic breast cancer for CTCs using two enrichment methods, the CellSearch system (Menarini Silicon Biosystems) and the Parsortix technology (ANGLE), and characterized the samples with regard to their HER2 status. In contrast to the CellSearch system, no good method for identifying HER2-positive CTCs exists for the marker-independent Parsortix system so far. That is why we established a suitable staining protocol by testing six different anti-HER2 antibodies and adjusting staining substances such as permeabilization and blocking solutions. Using the Parsortix system CTCs were detected in 9.76% of 82 samples from patients with metastatic breast cancer. In the 27 samples which were processed using both enrichment methods, the CellSearch system was superior in detecting CTCs as six blood samples were only detected as CTC positive using this technology. Also the number of CTCs detected appeared to be higher using the CellSearch system. To enable automatic evaluation of Parsortix cytospins, we tested the scan microscope Xcyto 10 (Chemometec) by scanning 27 slides that had been previously enriched using the Parsortix system and had been stained by our protocol. Afterwards we compared the results of automatic evaluation with those of manual enumeration using the fluorescence microscope. By establishing special gatings it was possible to detect tumor cells regarding various parameters such as HER2 intensity. In total the Xcyto 10 delivered convincing results in detection and visualization of tumor cells with 4x and 20x magnification. In conclusion our results have laid the foundation for further molecular and functional analyses, e.g., to gain new insights into mechanisms of resistance to HER2-targeted antibody therapy.
Keywords: CTC; HER2-positive; breast cancer; parsortix system; circulating tumor cells; liquid biopsy; CellSearch system; Xcyto 10; circulating tumor DNA; ctDNA; immuncytochemistry; HER2-gating
Deutsch
In der Klinik wird der HER2-Status bislang anhand von Gewebeproben aus Biopsien bestimmt. Da die Entnahme der Probe für die Patientinnen ein invasives, zeitintensives Verfahren darstellt, wird mittlerweile der Fokus vermehrt auf blutbasierte Biomarker wie z. B. zirkulierende Tumorzellen (CTCs) oder zirkulierende Tumor-DNA im Rahmen einer Liquid Biopsy gelegt. In diesem Zusammenhang analysierten wir das Blut von Patientinnen mit metastasiertem Brustkrebs auf CTCs mittels zweier Anreicherungsmethoden, dem CellSearch-System (Menarini Silicon Biosystems) und der Parsortix-Technologie (ANGLE), und charakterisierten die Proben hinsichtlich ihres HER2-Status. Im Gegensatz zum CellSearch-System existiert für das Marker-unabhängige Parsortix-System bislang keine gute Methode für die Identifizierung HER2-positiver CTCs, weswegen wir ein geeignetes Färbeprotokoll etablierten, indem sechs verschiedene anti-HER2-Antikörper ausgetestet und Färbesubstanzen wie Permeabilisierungen und Blockierungen angepasst wurden. Mithilfe des Parsortix-Systems konnten bei 9,76 % der 82 Proben von Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom CTCs detektiert werden. Bei den 27 Proben, die mittels beider Anreicherungsmethoden bearbeitet worden waren, war das CellSearch- dem Parsortix-System in der Detektion der zirkulierenden Tumorzellen überlegen, da sechs Blutproben nur mithilfe dieser Technologie als CTC-positiv erkannt wurden. Auch die Anzahl an erfassten CTCs war mittels des CellSearch-Systems höher. Um eine automatisierte Auswertung der Parsortix-Zytospins zu ermöglichen, testeten wir das Scanmikroskop Xcyto 10 (Chemometec), indem wir 27 Objektträger, welche im Vorfeld mithilfe des Parsortix-Systems angereichert und anhand unseres Protokolls angefärbt worden waren, einscannten und die Ergebnisse der automatisierten Auswertung mit denen der manuellen Auszählung unter dem Fluoreszenzmikroskop verglichen. Mithilfe der von uns etablierten Gatings konnten Tumorzellen anhand verschiedener Parameter detektiert und Aussagen über die HER2-Intensität gemacht werden. Das Xcyto 10 überzeugte sowohl in der Detektion als auch Darstellung der Tumorzellen in 4- und 20-facher Vergrößerung. Abschließend lässt sich sagen, dass mithilfe unserer Ergebnisse die Grundlage für weitere molekulare und funktionelle Analysen geschaffen wurde, um zukünftig z. B. neue Erkenntnisse über die Entstehung von Resistenzen gegenüber HER2-gerichteter Antikörpertherapie zu erlangen.
Schlagwörter: CTC; Zirkulierende Tumorzellen; Mammakarzinom; CellSearch System; Xcyto 10; Liquid Biopsy; HER2-Gating; Zirkulierende Tumor-DNA; ctDNA; Immunzytochemie; HER2-positiv