Multiplexing Mikroskopie für B-Zell-Differenzierung in humanen Multiple Sklerose-Läsionen
Multiplexing microscopy for B cell differentiation in human multiple sclerosis lesions
von Hanna Josephin Eisenberg
Datum der mündl. Prüfung:2023-05-16
Erschienen:2023-04-13
Betreuer:Prof. Dr. Freddy Wouters-Bunt
Gutachter:Prof. Dr. Freddy Wouters-Bunt
Gutachter:Prof. Dr. Francesca Odoardi
Zum Verlinken/Zitieren:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9833
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Name:Multiplexing_Mikroskopie_MS.pdf
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Format:PDF
Lizenzbestimmungen:
Zusammenfassung
Englisch
The aim of this project was to show that with the help of lifetime imaging the specific differentitation of immune cells via their CD expression patterns becomes possible. It was shown that with a double staining of CD20 and CD27 with two flurescence markers three cell lines can be seperated; CD27+CD20+ memory B cells, CD20+CD27- B cells and CD20-CD27+ T cells. The differentiation was posible via the use of FLIM (flurescence lifetime imaging) which allows not only the measurement of the specific lifetime of a fluorophore but also the detection coexistence of two markers through mixed lifetime values. To establish a staining including CD38 and CD138 as well primary antibodies with distinct host animals were tested. Unfortunately only antibodies from mice and rabbits were specific enough. Therefor a staining method using two primary antibodies from the same host animal needed to be established. As a final step the fluorescence stainings and FLIM were tested in ZNS tissue using a b cell lymphoma. The developed method is a first step to further classify b cells in MS lesions. It aims to combine several fluorescence markers to stain more cell lines in a single tissue slice. This allows for a better view on the interaction of different immune cells in MS and might therefor facilitate a better understanding of MS pathology.
Keywords: pathology; b cell; multiple sclerosis; FLIM; fluorescence; CD27
Deutsch
Das Ziel dieses Projektes war es, zu zeigen, dass mithilfe der Lifetime-Imaging-Technologie eine spezifische Differenzierung von Expressionsmustern auf Immunzellen möglich ist. Mit einer Doppelfärbung gegen CD20 und CD27 konnte gezeigt werden, dass mit nur zwei Fluoreszenzfarbstoffen drei verschiedene Zellpopulationen unterschieden werden können. CD27- und CD20-positive B-Gedächtniszellen heben sich deutlich von den CD20-positiven B-Zellen und den CD27-positiven T-Zellen ab. Eine eindeutige Differenzierung ist durch die Nutzung von FLIM somit möglich, da es diese erlaubt, nicht nur spezifische Lebensdauerwerte für die einzelnen Fluorophore zu messen, sondern auch Mischwerte bei Koexistenz zu detektieren. Die Differenzierbarkeit der Fluoreszenzfarbstoffe mittels Lebensdauer ist unabhängig von den Emissionsspektren. Somit können auch Farbstoffe mit sich überschneidenden Emissionsspektren genutzt werden, solange die Lebensdauer ausreichend distinkt ist. In einem weiteren Schritt ging es darum, auch Färbungen gegen CD38 und CD138 zu testen und alle vier Erstantikörper auf deren Kombinierbarkeit zu prüfen. Dafür würden sich Erstantikörper gegen die CD-Moleküle aus vier verschiedenen Wirtstieren und dann jeweils wirtsspezifische, fluoreszenzgekoppelte Zweitantikörper anbieten. Leider stehen diese Erstantikörper in guter Qualität nur aus der Maus und dem Kaninchen zur Verfügung. Daher war als nächster Schritt die Etablierung eines Färbeverfahrens notwendig, mit dem es möglich ist, wenigstens zwei Erstantikörper aus demselben Wirt in einer Färbung zu nutzen. Hierbei wurde vor allem auf die Sequenz und die Kombinierbarkeit der verwendeten Anti körper geachtet, wodurch neue und höhere Ansprüche an das Färbeprotokoll entstanden. Zuletzt wurde die Übertragbarkeit der Methode auf ZNS-Gewebe am Beispiel eines B-Zell Lymphoms gezeigt. Die hier erarbeitete Methodik schafft die notwendige Grundlage, B-Zellen in MS-Läsionen besser klassifizieren zu können. Durch die gute Differenzierbarkeit der verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe mittels Lebensdauermessungen stehen viele verschiedene Farbstoffe zur Verfügung, die in demselben Gewebeschnitt genutzt werden könnten. Auf diese Weise kann auf sequenzielle Färbungen verzichtet und ein hoher Erkenntnisgewinn insbesondere in Bezug auf das Verhältnis der verschiedenen Zielstrukturen zueinander erzielt werden. Somit bietet sich die Möglichkeit, herauszufinden, welche B-Zellpopulationen maßgeblich an der Pathogenese der MS beteiligt sind, um diese als spezifisches Ziel zukünftiger Therapien zu nutzen.
Schlagwörter: B-Zellen; Multiple Sklerose; Pathologie; Differenzierung; Lebensdauer
