SUMOylierung in Nervenzellen und deren Regulation durch Sauerstoff und Glukose

Breitenbach, Aline

dc.contributor.advisor	Brose, Nils Prof. Dr.
dc.contributor.author	Breitenbach, Aline
dc.date.accessioned	2023-04-27T16:04:37Z
dc.date.issued	2023-04-27
dc.identifier.uri	http://resolver.sub.uni-goettingen.de/purl?ediss-11858/14644
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9851
dc.format.extent	XXX Seiten	de
dc.language.iso	deu	de
dc.subject.ddc	610	de
dc.title	SUMOylierung in Nervenzellen und deren Regulation durch Sauerstoff und Glukose	de
dc.type	doctoralThesis	de
dc.title.translated	SUMOylation in neurons and its regulation by oxygen and glucose	de
dc.contributor.referee	Brose, Nils Prof. Dr.
dc.date.examination	2023-05-02	de
dc.description.abstractger	Small ubiquitin-like modifiers (SUMO) zählen zu den post-translational modifications (PTM) und werden als solche ähnlich wie Ubiquitin an dessen Zielproteine konjugiert. Dies erfolgt mittels einer energieabhängigen Enzymkaskade, für die das E1 Aos1-Uba2, das E2 Ubc9 und in manchen Fällen eine von vielen E3-Ligasen notwendig sind. Auf diese Weise kann die SUMO-Konjugation Protein-Protein-Interaktionen, die intrazelluläre Lokalisation und die Funktion der Zielproteine beeinflussen. Da die SUMOylierung an Prozessen zur Erhaltung der Zellhomöstase beteiligt ist, unterliegt sie Einflüssen wie beispielsweise hypoxischem und ischämischen Stress. Dabei wird insbesondere die Konjugation mit SUMO2/3 beeinflusst, das neben SUMO1 zu den wesentlichen Isoformen in Mäusen zählt und deshalb bereits gut charakterisiert wurde. Bei dem Krankheitsbild eines Apoplexes, der heutzutage die dritthäufigste Todesursache in der westlichen Hemisphäre darstellt, kommt es zu einer Minderperfusion eines Gehirnabschnitts und infolge dessen zu einer Ischämie, die zu Gewebsnekrosen führen kann. Um die Mechanismen der hirninfarktbedingten Schäden näher zu beleuchten und ebenfalls diejenigen der endogenen Neuroprotektion aufzuklären, kann das In-vitro-Modell des oxygen-glucose deprivation (OGD) genutzt werden. In den bisher zu dieser Thematik veröffentlichten Studien konnte überwiegend ein Anstieg der SUMO2/3- Konjugat-Level gezeigt werden. Da die dabei in den Arbeitsgruppen verwendeten Methoden sehr inhomogen sind und sich der Versuchsaufbau maßgeblich voneinander unterscheidet, hatte diese Studie zum Ziel, ein geeignetes Protokoll zu erstellen und die möglichen neuroprotektiven Eigenschaften der SUMOylierung unter hypoxischen und ischämischen Bedingungen weitgehender zu untersuchen. Dafür wurden primäre hippokampale und kortikale Neuronen-Kulturen von E16 Wildtyp-Mäusen an DIV10 für 1 h, 4 h und 8 h OGD-Stress mit und ohne Reoxygenierung ausgesetzt. Dabei wurde vor dem Transfer der Zell-Kulturen in die Hypoxiekammer das Medium durch Glukose-freies Medium ersetzt und die Zellen für bestimmte Zeitspannen bei 1% Sauerstoff-Luft-Anteil inkubiert. Die SUMO2/3-Konjugat-Level wurden nach Lyse mithilfe von Immunoblotting bestimmt und mithilfe der Software ImageJ analysiert. Dabei konnte ein Abfall der SUMO2/3-Konjugate unter OGD Stress ohne Reoxygenierung gezeigt werden, wohingegen sich die Konjugat-Level unter Reoxygenierung nicht veränderten. Da es sich bei Neuronen um postmitotische Zellen handelt und der Zellumsatz über längere Zeit erfolgt, wurden hochproliferierende humane retinal pigment epithelial cells (RPE1) einer Stunde OGD-Stress ausgesetzt. Hierbei handelte es sich sowohl um Wildtyp-Zellen, als auch um Knockout-Zellen der stresssensitiven E3-Ligase ZNF451-1. Auch hier konnte eine Reduktion der SUMO2/3- Konjugat-Level beobachtet werden. Dies jedoch primär in den Knockout-Zellen, wohingegen die Wildtyp-Zellen keine Veränderung der SUMOylierung zeigten. Um die Reaktion der SUMO2/3-Konjugat-Level in hochproliferierenden Zellen zu untersuchen, die im Zusammenhang mit dem Zellstoffwechsel der Neurone stehen, wurden Astrozyten-Kulturen von P0 Wildtyp-Mäusen für 1 h, 2 h, 4 h und 8 h OGD-Stress ausgesetzt. Hierbei konnten die Ergebnisse in kortikalen Neuronen bestätigt werden und ebenfalls ein Abfall der SUMO2/3-Konjugate verzeichnet werden. Sauerstoff dient nicht nur bei pathologischen Prozessen als Regulator grundlegender Stoffwechsel-Vorgänge, sondern auch bei physiologischen. Um die Rolle der SUMOylierung hierbei näher zu beleuchten, wurden primäre Neuronen- und Astrozyten-Kulturen für 1 h, 2 h, 4 h und 8 h alleiniger Hypoxie ausgesetzt. Es konnte in der Analyse mithilfe des Immunoblottings in allen getesteten Zell-Kulturen ein signifikanter Abfall der SUMO2/3-Konjugat-Level beobachtet werden. Nicht nur akut hypoxischer Stress führt in primären hippokampalen und kortikalen Neuronen-Kulturen zu einem Abfall der SUMO2/3-Konjugate, sondern auch eine chronisch hypoxische Behandlung bei 1% und 6% Sauerstoff-Luft-Anteil über eine Zeitspanne von 6 h pro Tag an fünf aufeinander folgenden Tagen führt in den Zell-Kulturen zu einer Reduktion der SUMO2/3-Konjugate. Zusammenfassend konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass die Veränderung der SUMO2/3-Konjugat-Level an der Antwort der Neurone und Astrozyten auf ischämischen und hypoxischen Stress beteiligt ist. Dass die SUMOylierung einen neuroprotektiven Einfluss ausübt, konnte hierbei nicht festgestellt werden, da in allen Experimenten-Ansätzen ein Abfall der SUMO2/3-Konjugat-Level verzeichnet wurde. Diese Ergebnisse stehen dem Großteil der bisher veröffentlichten Studien gegenüber, was auf die unterschiedlichen Ansätze, Methoden und Qualität der Arbeiten zurückgeführt werden kann. Die Umstände, dass die In-vitro-Ergebnisse in den bisher veröffentlichten Arbeiten heterogen sind und diejenigen der In-vivo-Modelle sich homogener darstellen, legen die Schlussfolgerung nahe, dass in vivo möglicherweise der grundlegende Mechanismus der reaktiven Signalkaskaden unterschiedlich ist oder das Zusammenspiel der verschiedenen Zelltypen eines Gewebes entscheidend ist. Deshalb sollte eine Reproduktion der in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse in vivo angestrebt werden. Zudem kann die Bestimmung des veränderten Proteoms für die SUMOylierung unter hypoxischem und ischämischen Stress als sinnvoll erachtet werden, um die Prozesse der Stress-Antwort besser verstehen zu können.	de
dc.description.abstracteng	Small ubiquitin-like modifiers (SUMO) are post-translational modifications (PTM) which, similar to Ubiquitin, are conjugated to specific target proteins. The conjugation is based on an energy-dependent enzymatic cascade, for which the E1 Aos1-Uba2, the E2 Ubc9 and in some cases one of many E3-Ligases are required. SUMO-conjugation then influences protein-protein-interactions, intracellular localization, and the function of the target protein. Because SUMOylation targets a wide variety of proteins involved in almost all signaling pathways, SUMOylation is involved in processes that maintain cellular homeostasis and is affected by hypoxic and ischemic stress. Three SUMO paralogs have been well characterized so far, SUMO1, 2 and 3. In particular, the conjugation with SUMO2/3 is influenced by various stress conditions. Within the disease profile of stroke, which is the third most common death cause in the western hemisphere, an ischemia can be caused by the hypoperfusion of a brain section, which can then result in tissue necrosis. To gain further insight into the mechanisms of damages caused by a cerebral infarct and into the research of the mechanisms of endogenic neuroprotection, an in-vitro-model of the oxygen and glucose deprivation (OGD) can be used. Published studies related to this topic were able to demonstrate an increase of SUMO2/3-conjugate-level under hypoxic and ischemic stress. Since the methods used in the working groups are very inhomogeneous and the experimental setups differ significantly, this study aimed to create a suitable protocol in order to investigate the possible neuroprotective properties of SUMOylation under hypoxic and ischemic conditions. To this end, primary hippocampal and cortical neurons or astrocytes were cultured from E16 wild-type mice and exposed to OGD stress with and without reoxygenation at 1% oxygen in air for 1 h, 4 h and 8 h after 10 days in vitro (DIV). Before the cell cultures were transferred to the hypoxia chamber, the medium was replaced by glucose-free medium and the cells were then incubated for specific periods of time with 1% oxygen-air content. After cell lysis and Western-Blotting, the SUMO2/3-conjugate-levels were analyzed using the software ImageJ. Strikingly, in contrast to the in-vivo data, we observed a decrease of the SUMO2/3-conjugate in all cell types (e.g., primary hippocampal and cortical neurons, astrocytes) under OGD stress without reoxygenation, whereas no change of the conjugate-level was observed after reoxygenation. Since neurons are postmitotic cells with cellular turnover occurring over an extended period of time, highly proliferating humane retinal pigment epithelial cells (RPE1) were exposed to OGD stress for one hour. The treated cells were wild-type cells as well as knockout-cells of the stress sensitive SUMO E3-ligase ZNF451-1. A decrease of the SUMO2/3-conjugate-level was observed primarily for the knockout-cells, whereas the wild-type cells exhibited no change in SUMOylation-levels. In order to analyze the response of SUMO2/3-conjugate-level in highly proliferating cells, that are related to the cellular metabolism of neurons, astrocyte cell cultures of P0 wild-type mice were exposed to OGD stress for 1 h, 4h and 8h. The results for the cortical neurons under OGD stress were confirmed and a reduction of the SUMO2/3-conjugate-level was also documented in astrocytes. Oxygen serves as a regulator of basic metabolic processes not only in pathological processes, but also in physiological ones. To elucidate the role of SUMOylation in this context, primary neuron and astrocyte cultures were also exposed to hypoxia alone for 1 h, 2 h, 4 h, and 8 h. The results of the analysis by immunoblotting showed also a significant decrease in SUMO2/3 conjugate levels in all tested cell cultures. Not only acute hypoxic stress led to a decrease in SUMO2/3 conjugates in primary hippocampal and cortical neuron cultures, but also chronic hypoxic treatment at 1% and 6% oxygen-air levels for a period of 6 h per day for five consecutive days. In summary, this study was able to demonstrate that the change of the SUMO2/3-conjugate-level participates in the response of neurons and astrocytes to ischemic and hypoxic stress. A neuroprotective role of SUMOylation was not asserted. These results stand in contrast to the majority of the published studies which can be related to the different methods of preparation and procedures as well as the varying quality of the published papers. The fact that the in-vitro results are quite heterogeneous and therefore differ from the in-vivo result, which are rather homogeneous, leads to the assumption that either fundamental mechanisms of the responsive signal cascades are different or the synergy of tissue is decisive. Therefore, a reproduction of the presented results in-vivo should be addressed next. Additionally, the analysis of the modified proteome of SUMOylation under hypoxic and ischemic stress could be a reasonable next step in order to gain further insight into the process of stress response.	de
dc.contributor.coReferee	Katschinski, Dörthe Prof. Dr.
dc.subject.ger	OGD	de
dc.subject.ger	MCAO	de
dc.subject.ger	SUMO2/3	de
dc.subject.ger	Schlaganfall	de
dc.subject.ger	SUMOylierung	de
dc.subject.ger	ZNF451-1	de
dc.subject.ger	MG-132	de
dc.subject.ger	Ischämie	de
dc.subject.ger	Hypoxie	de
dc.subject.ger	Neuron	de
dc.subject.ger	Astrozyt	de
dc.subject.ger	E16	de
dc.subject.ger	Maus	de
dc.subject.ger	RPE1	de
dc.subject.ger	HIF1α	de
dc.subject.ger	Western-Blot	de
dc.subject.eng	OGD	de
dc.subject.eng	SUMO2/3	de
dc.subject.eng	ischemia	de
dc.subject.eng	hypoxia	de
dc.subject.eng	neuron	de
dc.subject.eng	astrocyte	de
dc.subject.eng	RPE1	de
dc.subject.eng	ZNF451	de
dc.subject.eng	MG-132	de
dc.subject.eng	MCAO	de
dc.subject.eng	SUMOylation	de
dc.subject.eng	Ubiquitin	de
dc.subject.eng	stroke	de
dc.subject.eng	E16	de
dc.subject.eng	mouse	de
dc.subject.eng	HIF1α	de
dc.subject.eng	western blot	de
dc.identifier.urn	urn:nbn:de:gbv:7-ediss-14644-3
dc.date.embargoed	10000-01-01
dc.affiliation.institute	Medizinische Fakultät	de
dc.subject.gokfull	Biochemie / Physiologische Chemie / Pathobiochemie - Allgemein- und Gesamtdarstellungen (PPN619875313)	de
dc.subject.gokfull	Physiologie / Pathophysiologie - Allgemein- und Gesamtdarstellungen (PPN619875283)	de
dc.subject.gokfull	Neurologie - Allgemein- und Gesamtdarstellungen (PPN619876247)	de
dc.description.embargoed	unknown	de
dc.identifier.ppn	1843945622
dc.notes.externeng	These files are not accessible until the state exam has been completed.
dc.notes.confirmationsent	Confirmation sent 2023-04-27T19:45:01	de
dc.description.embargotextger	Diese Dateien sind bis zum Abschluß der Staatsexamensprüfung gesperrt.

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Human- und Zahnmedizin [2872]

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