Der Einfluss von Mikrofluidik auf das Wachstum retinaler Ganglienzellen in vitro
The influence of microfluidics on the neurite outgrowth of primary cultured rodent retinal ganglion cells
by Vincent Deppe
Date of Examination:2023-06-07
Date of issue:2023-06-01
Advisor:PD Dr. Christian van Oterendorp
Referee:Prof. Dr. Tim Gollisch
Referee:Prof. Dr. Margarete Schön
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9888
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Name:Dissertation_VDeppe_Einfluss_Mikrofluidik_RGCs.pdf
Size:1.83Mb
Format:PDF
Description:Dissertationsschrift
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Abstract
English
Purpose: Low extracellular fluid microfluidics influences the direction of growth and the length of outgrowing neurites. This is methodologically relevant for primary cultures with directed neurite outgrowth. Furthermore this concept may gain importance in regard of strategies for neuronal replacement with stem cells in vivo. Our own preliminary work showed that retinal ganglion cells (RGCs) respond highly sensitive to flow conditions above microfluidic flow rates. We therefore investigated the influence of lower flow rates on these parameters in RGCs. Methods: Primary retinal cell cultures from postnatal Wistar rats (P0-6) were exposed to two different microfluidic flow rates (4*10e-5 and 2*10e-6 ml/min, or non-flow as control) after 24 h in culture for an additional 24 h. After subsequent immunostaining of RGCs with anti β III tubulin, RGC cell density, the length of the longest neurite, the average length of the other neurites and number of neurites per RGC were determined. Results: We established a set-up with a flow chamber for primary cell cultures that allowed the calculation of cellular shear stress induced by defined flow rates. A flow rate of 4*10e-5 ml/min (n = 5 experiments) resulted in lower RGC density compared to non-flow (factor 0.68 ± 0.29; p = 0.06) and significantly lower density compared to the lower flow of 2*10e-6 ml/min (n = 7; factor 1.0 ± 0.17, p = 0.03). The lower flow rate, but not the higher flow rate, significantly increased the growth of the longest neurite compared to non-flow (factor 1.4 ± 0.13, p = 0.0003). At the same time, growth of all other neurites was significantly inhibited at both flow rates (4*10e-5 ml/min: Factor 0.7 ± 0.13 (p = 0.005) and 2*10e-6 ml/min: 0.8 ± 0.18 (p = 0.02). Thus, the length ratio between the longest and the average of the remaining neurites increased significantly at both flow rates compared to non-flow (factor 2.4 ± 0.7 (p = 0.01) and 2.2 ± 0.6 (p = 0.003)). Conclusions: The results suggest that at flow rates < 4*10e-5 ml/min the degenerative effect on RGC ends. Both flow rates lead to a differential change in neurite growth with promotion of the longest and inhibition of the remaining neurites. This may reflect increased differentiation between axon and dendrites. We presume that these effects are transduced via mechanosensitive calcium-channels.
Keywords: Retinal ganglion cell; Microfluidics; Neurite outgrowth; Axonal guidance; Neurite differentiation; TRPV4
German
Fragestellung: Geringe extrazelluläre Mikrofluidik kann Wachstumsrichtung und Länge auswachsender Neuriten beeinflussen. Dies ist methodisch relevant für Primärkulturen mit gerichtetem Neuritenwachstum, ggf. aber auch für Strategien zum neuronalen Ersatz mit Stammzellen in vivo. Eigene Vorarbeiten zeigten, dass primäre Kulturen retinaler Ganglienzellen (RGC) sehr sensitiv auf extrazelluläre Flüssigkeitsströme oberhalb der Mikrofluidik-Grenze reagieren. Wir untersuchten daher den Einfluss niedrigerer, mikrofluidischer Flussraten auf diese Parameter bei RGC. Methodik: Primäre retinale Zellkulturen von postnatalen Wistar-Ratten (P0-6), wurden nach 24 h in Kultur weiteren 24 h zwei verschiedenen mikrofluidischen Flussraten (4*10e-5 und 2*10e-6 ml/min, bzw. keinem Fluss (Non-Flow) als Kontrolle) ausgesetzt. Nach anschließender Immunfärbung der RGC mit Anti-β-III-Tubulin wurde die RGC-Zelldichte, Länge des längsten Neuriten, Durchschnittslänge der anderen Neuriten und die Anzahl der Neuriten pro RGC bestimmt. Ergebnisse: Eine Flusskammer für primäre Zellkulturen wurde etabliert und hinsichtlich der Scherkräfte bei gegebenem Gesamt-Volumenstrom charakterisiert. Eine Flussrate von 4*10e-5 ml/min (n = 5 Versuche) führte zu einer tendenziell geringeren RGC-Dichte gegenüber Non-Flow (Faktor 0,68 ± 0,29; p = 0,06) und zu einer signifikant niedrigeren Dichte gegenüber dem geringeren Fluss von 2*10e-6 ml/min (n=7; Faktor 1,0 ± 0,17, p = 0,03). Die geringere Flussrate, nicht aber die höhere, steigerte das Wachstum des längsten Neuriten signifikant gegenüber Non-Flow (Faktor 1,4 ± 0,13, p = 0,0003). Gleichzeitig wurde das Wachstum aller anderen Neuriten bei beiden Flussraten signifikant gehemmt (4*10e-5 ml/min: Faktor 0,7 ± 0,13 (p = 0,005) und 2*10e-6 ml/min: 0,8 ± 0,18 (p = 0,02). Dadurch stieg das Längenverhältnis zwischen dem längsten und dem Durchschnitt der übrigen Neuriten bei beiden Flussraten signifikant gegenüber Non-Flow an (Faktor 2,4 ± 0,7 (p = 0,01) und 2,2 ± 0,6 (p = 0,003)). Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass bei Flussraten < 4*10e-5 ml/min der degenerative Effekt auf RGC endet. Beide Flussraten führen zu einer differenziellen Änderung des Neuritenwachstums mit Förderung des längsten und Hemmung der übrigen Neuriten. Dies könnte Ausdruck der verstärkten Differenzierung zwischen Axon und Dendriten sein. Wir vermuten weiterhin einen mechanistischen Zusammenhang dieser Effekte mit mechanosensitiven Ca2+ Kanälen.
Schlagwörter: Retinale Ganglienzellen; Mikrofluidik; Neuriten Wachstum; Axon Führung; Neuriten Differenzierung; TRPV4
