Konstruktion eines vaskularisierten 3D-Zellkultursystems zur Bildung künstlicher Knochenkonstrukte und Untersuchung des Einflusses von Kollagen Typ I auf die osteogene Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen
Construction of a vascularized 3D cell culture system for creating artificial bone constructs and investigating the impact collagen type I has on osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells
von Samuel Siegk
Datum der mündl. Prüfung:2023-07-18
Erschienen:2023-07-17
Betreuer:Prof. Dr. Arndt Schilling
Gutachter:Prof. Dr. Arndt Schilling
Gutachter:Prof. Dr. Susanne Lutz
Zum Verlinken/Zitieren:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10010
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Zusammenfassung
Englisch
Osteogenesis is a complex process of differentiation where osteogenic stem cells interact with vessels, cartilage cells, others tissue types and extracellular matrix. This process is also affected by nutritive, structural and mechanical properties of the microenvironment in the cell. The 3D cell culture system established in this study consists of a bioreactor including a perfusion system for vascularized hydrogel cultures. It enables a several week long cell culture which the adult multipotent stem cells require for osteogenisis. In doing so it is an easily reproducible method that can be used in conventional laboratories to form histocompatible tissue substitutes or to research the composition of artificial bone constructs. This cell culture system is, compared to conventional 2D cell culture osteogenesis, superior due to higher marker expression levels. Osteoinductive effects can be observed without the addition of osteogenic differentiation medium. This osteoinduction could be justified by observations that point to a formation of perfusion gradients, differentiation gradients and an interaction with chondrogenesis depending on the distance to the perfusion channel delivery. These clues should be checked in future experiments. Contrary to our expectations the selection of unmodified PEGDA 6000 hydrogel cultures as a synthetic hydrogel environment without bioactive possibility of formation of cell-matrix contacts proved to be supportive of osteogenesis. Whether the effects are directly linked to the PEGDA 6000 or rather influenced by for example polarization and hydrophilicity-related deposition of matrix components should to be further investigated. A supporting effect of collagen type I on the Osteogenesis, which was tested by addition of a methacrylated telopeotid-intact bovine type I collagen (ColMa), could not be displayed. However, observations suggested that the collagen acted as a catalyst for mineralization. The cell biological and bioreactor technological findings of this work can already be used in the field of tissue engineering today and will therefore be clinically relevant in the future. These findings can not just improve articifical bone constructs, they can also benefit further experiments in the broad field of 3D-cell cultures.
Keywords: tissue engineering; osteogenesis; ossification; mineralisation; bone; bioreactor; collagen type I; micro ct; histology; PEGDA; polyethylenglykol diacrylat; vascularisation; cryosections; cell culture; 3d cell culture
Deutsch
Bei der Osteogenese handelt es sich um ein komplexes Differenzierungsgeschehen, das einer Interaktion von osteogenen Stammzellen mit Gefäßen, Knorpelzellen, weiteren Gewebetypen sowie der extrazellulären Matrix bedarf und zusätzlich durch nutritive, strukturelle und mechanische Eigenschaften des Mikromilieus in der Zellumgebung beeinflusst wird. Das in dieser Studie etablierte 3D Zellkultursystem besteht aus einem Bioreaktor inklusive Perfusionssystem für vaskularisierte Hydrogelkulturen und ermöglicht eine für die Osteogenese benötigte mehrwöchige Kultur adulter multipotenter Stammzellen. Dabei stellt es eine leicht reproduzierbare und in herkömmlichen Laboren einsetzbare Möglichkeit dar, histokompatible Gewebeersatzprodukte zu bilden oder an der Zusammensetzung von künstlichen Knochenkonstrukten zu forschen. Dieses Zellkultursystem zeigte sich der herkömmlichen 2D-Zellkultur bei der Osteogenese durch höhere Markerexpressions-Level überlegen und osteoinduktive Effekte konnten bereits ohne die Zugabe von osteogenem Differenzierungsmedium beobachtet werden. Diese Osteoinduktion könnte durch Beobachtungen begründet werden, die Hinweise auf eine Ausbildung von Perfusionsgradienten, Differenzierungsgradienten und einer Interaktion mit der Chondrogenese in Abhängigkeit der Entfernung zum Perfusionskanal liefern. Diese Hinweise sollten in zukünftigen Experimenten überprüft werden. Die Auswahl der unmodifizierten PEGDA-6000-Hydrogelkultur als eine synthetische Hydrogelumgebung ohne bioaktive Möglichkeit der Ausbildung von Zell-Matrix-Kontakten, zeigte sich entgegen unseren Erwartungen als unterstützend bei der Osteogenese. Ob es sich hierbei um direkte Effekte des PEGDA 6000 oder indirekte Effekte beispielsweise durch Polarisation und Hydrophilie bedingter Ablagerung von Matrixkomponenten handelt, sollte weiterführend geklärt werden. Ein unterstützender Effekt von Kollagen Typ I auf die Osteogenese, welcher in dieser Studie durch Zusatz eines methacrylierten telopeotid-intakten bovinen Typ I Kollagens (ColMa) untersucht wurde, konnte nicht dargestellt werden. Hingegen ließen Beobachtungen auf eine Interaktion der Mineralisierung mit den Kollagenanteilen in der Funktion eines Kristallisationskeims schließen. Die zellbiologischen und bioreaktortechnologischen Erkenntnisse dieser Arbeit lassen sich schon jetzt im Bereich des Tissue Engineerings anwenden und besitzen damit zukünftig eine klinische Relevanz. Dabei können sie einerseits für die Verbesserung von künstlichen Knochenkonstrukten, aber auch für weitere Experimente auf dem breiten Feld der 3D-Zellkultur genutzt werden.
Schlagwörter: 3D Zellkultur; Stammzellen; Mesenchymale Stammzellen; Osteogenese; Knochen; Artifizieller Knochen; Bioreaktur; Vaskularisation; Chondrogenese; micro CT; Ossifikation; Mineralisation; Kollagen Typ I; Histologie; PEGDA; Polyethylenglykol Diacrylat; Zellkultur
