Interplay between α-synuclein expression and 26S proteasome chaperone Rpn14 and Rpn11 deubiquitinase in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae

by Dajana Gałka
Doctoral thesis
Date of Examination:2022-10-19
Date of issue:2023-10-17
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Stefanie Pöggeler
Referee:Prof. Dr. Tiago Fleming Outeiro
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10135

 

 

Files in this item

Name:PhD thesis_Dajana Galka_FINAL for submission.pdf
Size:5.12Mb
Format:PDF

The following license files are associated with this item:

Abstract

English

Alpha-synuclein (αSyn) in a misfolded state is the main component of Lewy bodies (LBs). These filamentous cytoplasmic inclusions are the neuropathological hallmark of Parkinson’s disease (PD). αSyn aggregates in LBs are prominently phosphorylated at serine 129 (pS129), suggesting that this posttranslational modification is linked to pathogenicity. Increasing amounts of toxic αSyn species indicate significant perturbation of protein homeostasis in PD. The central question of this thesis focuses on the analysis of the interplay of αSyn with two important components of a functional 26S proteasome: (i) the Rpn14 proteasome assembly chaperone and (ii) the Rpn11 deubiquitinase. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae was used as eukaryotic reference cell to investigate the impact of αSyn on protein homeostasis and the interplay between αSyn and proteins associated with 26S proteasome. Expression of αSyn in yeast results in growth impairment and cytoplasmic protein inclusions resembling the aggregates observed within LBs. A tandem fluorescent protein timer (tFT) was exploited to perform a high-throughput screen for proteins with altered turnover upon expression of αSyn or a phosphorylation-deficient S129A mutant. The impact of αSyn on the changes in protein stability was more significant than that of S129A. One of the top hits with different stability depending on the phosphorylation state of αSyn was the Rpn14 assembly chaperone of the 26S proteasome. αSyn expression increased the stability of Rpn14, whereas S129A had an opposite effect. High levels of Rpn14 were deleterious to yeast cells and enhanced αSyn-induced growth retardation. Elevated Rpn14 or αSyn levels increased the accumulation of ubiquitin conjugates upon depletion of the proteasome base subunits Rpt2, Rpt4 or Rpt6. Rpn14 overexpression resulted in accumulation of pS129, suggesting that Rpn14 is directly involved in the turnover of phosphorylated αSyn. Bimolecular Fluorescence Complementation assay (BiFC) revealed a physical interaction between Rpn14 and αSyn. Expression of αSyn and an increased Rpn14 level resulted in decreased 26S activity. The effect was specific for pS129 αSyn. These results demonstrate that inhibition of the proteasomal activity by phosphorylated αSyn in yeast is mediated by the proteasome chaperone Rpn14. Rpn11 is a deubiquitinating enzyme of the 26S proteasome. Downregulation of the corresponding RPN11 gene in combination with high levels of αSyn resulted in depletion of the pool of cellular ubiquitinated proteins and enhanced αSyn mediated toxicity. Rpn11 deubiquitinase promotes the degradation of phosphorylated αSyn. In absence of the intrinsically disordered Sem1 proteasome subunit that is required for stabilization of Rpn11, stabilization of αSyn was observed. Expression of αSyn upon deletion of SEM1 resulted in increased accumulation of ubiquitinated conjugates. This indicates a complex crosstalk between αSyn and Rpn11. This study corroborates a complex mechanistic interplay between proteasome and pS129 αSyn causing a substantial altered protein homeostasis in yeast as model for PD.
Keywords: Parkinson's disease; alpha-synuclein; 26S proteasome; proteasomal chaperone; yeast; protein homeostasis; tandem fluorescent protein timer; posttranslational modifications

German

Alpha-Synuclein (αSyn) in fehlgefaltetem Zustand ist der Hauptbestandteil der Lewy Bodies (LBs). Diese fadenförmigen zytoplasmatischen Einschlüsse sind das neuropathologische Markenzeichen der Morbus Parkinson. αSyn-Aggregate in LBs sind in hohem Maße an Serin 129 (pS129) phosphoryliert, was darauf hindeutet, dass diese posttranslationale Modifikation mit der Pathogenität verbunden ist. Zunehmende Mengen toxischer αSyn-Spezies weisen auf eine erhebliche Störung der Proteinhomöostase bei Morbus Parkinson hin. Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit konzentriert sich auf die Analyse des Zusammenspiels von αSyn mit zwei wichtigen Komponenten eines funktionellen 26S-Proteasoms: (i) dem Rpn14-Chaperon für die Proteasom-Assemblierung und (ii) der Rpn11-Dubiquitinase. Die Knospenhefe Saccharomyces cerevisiae wurde als eukaryotische Referenzzelle verwendet, um die Auswirkungen von αSyn auf die Proteinhomöostase und das Zusammenspiel zwischen αSyn und mit dem 26S-Proteasom assoziierten Proteinen zu untersuchen. Die Expression von αSyn in Hefe führt zu Wachstumsstörungen und zytoplasmatischen Proteineinschlüssen, die den in LBs beobachteten Aggregaten ähneln. Mit Hilfe eines Tandem-Fluoreszenzprotein-Timers (tFT) wurde ein Hochdurchsatz-Screening nach Proteinen mit verändertem Umsatz bei Expression von αSyn oder einer phosphorylierungsdefizienten S129A-Mutante durchgeführt. Der Einfluss von αSyn auf die Veränderungen der Proteinstabilität war deutlicher als der von S129A. Einer der Top-Treffer mit unterschiedlicher Stabilität in Abhängigkeit vom Phosphorylierungszustand von αSyn war das Montagechaperon Rpn14 des 26SProteasoms. Die Expression von αSyn erhöhte die Stabilität von Rpn14, während S129A einen gegenteiligen Effekt hatte. Hohe Rpn14-Konzentrationen waren für Hefezellen schädlich und verstärkten die αSyn-induzierte Wachstumsverzögerung. Erhöhte Rpn14- oder αSyn-Konzentrationen verstärkten die Anhäufung von UbiquitinKonjugaten nach Ausschaltung der Proteasom-Basisuntereinheiten Rpt2, Rpt4 oder Rpt6. Die Überexpression von Rpn14 führte zu einer Akkumulation von pS129, was darauf hindeutet, dass Rpn14 direkt am Umsatz von phosphoryliertem αSyn beteiligt ist. Der Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementations-Assay (BiFC) zeigte eine physikalische Interaktion zwischen Rpn14 und αSyn. Die Expression von αSyn und ein erhöhter Rpn14-Spiegel führten zu einer verringerten 26S-Aktivität. Der Effekt war spezifisch für pS129 αSyn. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Hemmung der proteasomalen Aktivität durch phosphoryliertes αSyn in Hefe durch das ProteasomChaperon Rpn14 vermittelt wird. Rpn11 ist ein deubiquitinierendes Enzym des 26S-Proteasoms. Die Herunterregulierung des entsprechenden RPN11-Gens in Kombination mit hohen αSyn-Spiegeln führte zu einer Verarmung des Pools an zellulären ubiquitinierten Proteinen und zu einer verstärkten αSyn-vermittelten Toxizität. Die Rpn11- Dubiquitinase fördert den Abbau von phosphoryliertem αSyn. In Abwesenheit der intrinsisch gestörten Proteasom-Untereinheit Sem1, die für die Stabilisierung von Rpn11 erforderlich ist, wurde eine Stabilisierung von αSyn beobachtet. Die Expression von αSyn nach Deletion von SEM1 führte zu einer erhöhten Akkumulation von ubiquitinierten Konjugaten. Dies deutet auf eine komplexe Wechselwirkung zwischen αSyn und Rpn11 hin. Diese Studie bestätigt ein komplexes mechanistisches Zusammenspiel zwischen Proteasom und pS129 αSyn, das eine erheblich veränderte Proteinhomöostase in Hefe als Modell für Morbus Parkinson verursacht.
 
Statistik