Etablierung einer spezifischen Färbung in der röntgenbasierten virtuellen Histologie von Lungenkarzinomen durch den Einsatz goldmarkierter Antikörper

Alves, Justus Caspar

dc.contributor.advisor	Dullin, Christian PD Dr.
dc.contributor.author	Alves, Justus Caspar
dc.date.accessioned	2023-11-22T10:20:08Z
dc.date.available	2023-12-05T00:50:10Z
dc.date.issued	2023-11-22
dc.identifier.uri	http://resolver.sub.uni-goettingen.de/purl?ediss-11858/14989
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10218
dc.format.extent	90	de
dc.language.iso	deu	de
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
dc.subject.ddc	610	de
dc.title	Etablierung einer spezifischen Färbung in der röntgenbasierten virtuellen Histologie von Lungenkarzinomen durch den Einsatz goldmarkierter Antikörper	de
dc.type	doctoralThesis	de
dc.contributor.referee	Dullin, Christian PD Dr.
dc.date.examination	2023-11-28	de
dc.description.abstractger	Das Lungenkarzinom ist weltweit für die meisten Todesfälle durch Tumorerkrankungen verantwortlich. Da sich die verschiedenen Subtypen der Erkrankung zum Teil in ihrer Prognose und den Therapiemöglichkeiten erheblich voneinander unterscheiden, ist eine genaue pathologische Diagnostik von zentraler Bedeutung. Neben molekulargenetischen Untersuchungen zur Identifizierung behandlungsrelevanter Mutationen spielen die morphologische Analyse sowie die Detektion tumorassoziierter Biomarker eine entscheidende Rolle. Die Standardverfahren dafür sind die Histologie bzw. die Immunhistochemie, die auf der Anfertigung von Gewebedünnschnitten basieren. Es entstehen zweidimensionale Daten, die das dreidimensionale Gewebe zum Teil nur eingeschränkt darstellen können. Zudem wird die Probe zerstört und es kommt zu Artefakten durch die Bearbeitungsschritte. Daher wurde in dieser Arbeit der Einsatz der Phasenkontrast Computertomografie als nichtdestruktive, dreidimensionale Bildgebungsmodalität zur Analyse von Lungentumorgewebe untersucht. Dafür wurden Stanzbiopsien von 1 mm Durchmesser am Synchrotron „Elettra“ in Triest (Italien) mittels der Phasenkontrast-CT-Modalität Propagation-based imaging (PBI) analysiert. Zusätzlich zur rein morphologischen Darstellung wurden Methoden zur spezifischen Färbung durch goldmarkierte immunologische Sonden evaluiert. Es konnte gezeigt werden, dass sich die Morphologie ungefärbter Lungentumor-Stanzbiopsien im PBI ähnlich detailreich wie in der konventionellen Histologie darstellen lässt. In den dreidimensionalen Aufnahmen konnten Tumorgrenzen klar identifiziert und der Verlauf von Leitungsbahnen räumlich nachvollzogen werden. Durch anschließende histologische Einbettung und Ermittlung der korrespondierenden Schnittebenen konnten die histologischen Schnitte mit virtuellen PBI-Schnitten überlagert werden. Eine elastische Transformation ermöglichte die Korrektur histologischer Schnittartefakte. Als spezifische Färbemethoden wurden zur Darstellung des EGF-Rezeptors (EGFR) und des Endothelmarkers CD31 in intakten Lungentumor-Stanzbiopsien zwei Ansätze untersucht. Zunächst wurden im zweistufigen Antikörpermodell gefärbte Stanzbiopsien mittels Fluoreszenzmikroskopie und PBI analysiert. Dazu wurde ein gleichzeitig sowohl gold- als auch fluorophor-markierter Sekundärantikörper verwendet. Dabei konnte zwar fluoreszenzmikroskopisch eine spezifische Färbung von Tumorgewebe mit unvollständiger Durchdringung gezeigt, aber im PBI keine lokale Kontrasterhöhung durch die Goldpartikel nachgewiesen werden. Deshalb sollte zukünftig der Einsatz von Gold- oder Silberverstärkungsprotokollen verfolgt werden. Parallel wurden mit dem Ziel einer verbesserten Gewebedurchdringung direkt goldmarkierte Nanobodies eingesetzt. Mit diesen zehnmal kleineren immunologischen Sonden konnten Kontrasterhöhungen gezeigt werden, allerdings unspezifisch im gesamten Randbereich der Proben. Diese Studie zeigt, dass sich das PBI als dreidimensionale Bildgebungsmodalität gut eignet, um kleine Weichgewebsbiopsien morphologisch darzustellen. Die in dieser Arbeit untersuchten spezifischen Färbemethoden können die Immunhistochemie aktuell noch nicht ersetzen. Eine Kombination von PBI und Immunhistochemie führt dagegen zu einem relevanten Informationsgewinn. Dies konnte an humanen Gewebeproben bestätigt werden. Für die routinemäßige klinische Anwendung bleibt die Notwendigkeit einer Synchrotron-Strahlenquelle eine Limitation. Laborbasierte Phasenkontrast-CT-Systeme, die dies ermöglichen könnten, sind Gegenstand aktueller Forschung.	de
dc.description.abstracteng	Lung cancer is the leading cause for cancer related deaths worldwide. Since the different subtypes can vary considerably in prognosis and available therapeutic options, a precise histopathological diagnosis is essential. Apart from molecular testing to identify therapy-relevant mutations, morphological tissue analysis as well as the detection of tumor-associated biomarkers play a key role. Histology and immunohistochemistry remain the gold standard for this. Since both rely on thin histological sections, they produce two-dimensional data which may not accurately represent complex three-dimensional tissue. Moreover, the samples are destroyed and various artefacts are introduced throughout the sample preparation. Therefore, the application of phase-contrast computed tomography (CT) as a non-destructive, three-dimensional imaging technique for visualization of lung tissue was examined. Punch biopsies of 1 mm diameter were analyzed at the synchrotron facility “Elettra” (Trieste, Italy) using the phase-contrast-CT modality propagation-based-imaging (PBI). In addition to a morphological tissue analysis, specific staining methods based on gold-labelled immunological probes were evaluated. It could be shown that the morphology of unstained lung tumor biopsies can be visualized with a comparable level of detail to conventional histology. In the 3D data, tumor borders and the spatial structure of anatomic pathways could be identified and traced. Through subsequent re-embedding, histological analysis and the identification of the corresponding sectional planes, histological sections could be superimposed with virtual CT sections. Artefacts from histological sectioning were corrected by using an elastic transformation algorithm. For the specific detection of the epithelial growth factor receptor (EGFR) and the endothelial marker CD31 in whole-mount lung tumor biopsies, two different approaches were examined. Firstly, biopsies stained by using a two-step antibody method were visualized using fluorescence microscopy and PBI. A secondary antibody conjugated with both gold and a fluorophore was used. In fluorescence microscopy, specific staining with incomplete tissue penetration could be shown, while there was no contrast elevation detectable in PBI. In future approaches, the application of gold- and silver-enhancement protocols should be pursued. Simultaneously, as a direct approach, gold-labelled nanobodies were used to improve tissue penetration. With these ten times smaller immunological probes, contrast elevations could be shown, albeit unspecific in the sample’s entire margin area. This study shows that PBI is a feasible 3D non-destructive imaging technique for visualizing the morphology of small soft tissue biopsies. The specific staining methods studied here cannot replace conventional immunohistochemistry at this point. A combination of PBI and subsequent immunohistochemistry leads to a relevant information gain. This could be validated using human tissue samples. The necessity of a synchrotron light source remains a key limitation for routine clinical application. Lab-based phase-contrast-CT systems are subject of ongoing research.	de
dc.contributor.coReferee	Bremmer, Felix PD Dr.
dc.subject.ger	Computertomografie	de
dc.subject.ger	Phasenkontrast	de
dc.subject.ger	Lungenkarzinom	de
dc.subject.ger	Biopsie	de
dc.subject.ger	Histologie	de
dc.subject.ger	Immunhistochemie	de
dc.subject.ger	Synchrotron	de
dc.subject.ger	Antikörper	de
dc.subject.ger	Gold	de
dc.subject.eng	computed tomography	de
dc.subject.eng	phase contrast	de
dc.subject.eng	propagation based imaging	de
dc.subject.eng	lung cancer	de
dc.subject.eng	biopsy	de
dc.subject.eng	histology	de
dc.subject.eng	immunohistochemistry	de
dc.subject.eng	EGFR	de
dc.subject.eng	CD31	de
dc.subject.eng	gold	de
dc.subject.eng	nanobodies	de
dc.subject.eng	synchrotron radiation	de
dc.identifier.urn	urn:nbn:de:gbv:7-ediss-14989-9
dc.affiliation.institute	Medizinische Fakultät	de
dc.subject.gokfull	Medizin (PPN619874732)	de
dc.subject.gokfull	Radiologie / Bildgebende Verfahren / Ultraschall / Nuklearmedizin / Strahlenschutz - Allgemein- und Gesamtdarstellungen (PPN619875585)	de
dc.description.embargoed	2023-12-05	de
dc.identifier.ppn	1871667372
dc.notes.confirmationsent	Confirmation sent 2023-11-22T10:45:01	de

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Human- und Zahnmedizin [3175]

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