Zur Interaktion von MYC mit TPX2 in der Mitose
Interaction of MYC with TPX2 in mitosis
von Charlotte Wittrock
Datum der mündl. Prüfung:2024-07-18
Erschienen:2024-07-15
Betreuer:Prof. Dr. Gerald Wulf
Gutachter:Prof. Dr. Gerald Wulf
Gutachter:Prof. Dr. Holger Bastians
Zum Verlinken/Zitieren:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10593
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Zusammenfassung
Englisch
The transcription factor MYC is one of the most frequently deregulated proteins in oncological diseases; it occupies a central position in malignant transformation due to its essential role in the regulation of proliferation. High MYC levels are associated with a reduced response to therapy and a poorer prognosis in a number of tumor entities. Mitotic cell division is the central process in the proliferation of somatic cells, with the mitotic spindle as the mechanism for the symmetrical distribution of chromosomes. The structural protein TPX2 has key functions in the organization of the spindle apparatus and is thus essential for the orderly progression of mitosis. Previous work had shown that MYC binds to the microtubules of the mitotic spindle via N-terminal parts, is protected from degradation to some extent and is thus transferred to the daughter cells. The aim of this work was to analyze how the spindle organizer TPX2 and MYC interact at the spindle. First, it was shown that the increased ectopic expression of TPX2 in the cell lines Hek 293 and HeLa led to an accumulation of MYC protein in the cells, indicating a functional link between TPX2 and MYC. Confocal immunofluorescence microscopy revealed a tight co-localization of TPX2 and MYC at the spindle apparatus, confirmed by proximity ligation assay. To further characterize the involved regions of MYC, the N-terminal fragments MYC-Nick, MYC-Nick short and the C-terminal fragment MYC-CTF were cloned and ectopically expressed, following the calpain-mediated physiological cleavage of MYC. Confocal immunofluorescence microscopy revealed the cytoplasmic MYC-Nick at the spindle apparatus during mitosis, MYC-CTF was localized in the nucleus during interphase and diffusely in the cytoplasm during mitosis. Immunoprecipitations of the native proteins and after crosslinking were performed to directly detect the interaction of MYC and TPX2, but no direct binding was detected. The results are most compatible with a model in which TPX2 and MYC are present on the spindle in a nanomilieu without direct protein interactions, corresponding to the liquid-liquid phase separation shown for TPX2 and tubulin. Functional analyses in vitro with cytostatic substances showed a reduced effect of the spindle-destabilizing cytostatic agent vincristine in TPX2- and thus also MYC-overexpressing cells. The reduced susceptibility to vincristine could be partially reversed by the additional use of Aurora kinase inhibitors. In summary, this work revealed a functional interaction of MYC and TPX2 associated with co-localization at the mitotic spindle. The interaction of MYC and TPX2 in mitosis allows the development of approaches for improved MYC-targeted tumor therapy.
Keywords: MYC; TPX2; Mitosis; microtubuli; cell biology
Deutsch
Der Transkriptionsfaktor MYC ist eines der häufigsten deregulierten Proteine bei onkologischen Erkrankungen, er nimmt durch seine essentielle Rolle in der Proliferationsregulation eine zentrale Position in der malignen Transformation ein. Hohe MYC-Level sind bei einer Reihe von Tumorentitäten mit einem verminderten Therapieansprechen und einer schlechteren Prognose vergesellschaftet. Die mitotische Zellteilung ist der zentrale Prozess der Proliferation somatischer Zellen, mit der mitotischen Spindel als Mechanismus zur symmetrischen Verteilung der Chromosomen. Das Strukturprotein TPX2 hat Schlüsselfunktionen in der Organisation des Spindelapparats, und ist so essentiell für den geordneten Ablauf der Mitose. In Vorarbeiten war gezeigt worden, dass MYC über N-terminales Anteile an die Mikrotubuli der mitotischen Spindel bindet, zu einen Anteil vor Degradation geschützt und so an die Tochterzellen übertragen wird. In dieser sollte Arbeit analysiert werden, wie der Spindelorganisator TPX2 und MYC an der Spindel interagieren. Zunächst wurde gezeigt, dass die vermehrte ektope Expression von TPX2 in den Zelllinien Hek 293 und HeLa zu einer Akkumulation von MYC-Protein in den Zellen führte, als Hinweis auf einen funktionellen Zusammenhang zwischen TPX2 und MYC. In der konfokalen Immunfluoreszenz-Mikroskopie zeigte sich eine enge Ko-Lokalisation von TPX2 und MYC am Spindelapparat, bestätigt mittels Proximity Ligation Assay. Um die beteiligten Regionen von MYC näher zu charakterisieren, wurden in Anlehnung an die Calpain-mediierte physiologische Spaltung von MYC die N-terminalen Fragmente MYC- Nick, MYC-Nick short und das C-terminale Fragment MYC-CTF kloniert und ektop exprimiert. In der konfokalen Immunfluoreszenz-Mikroskopie zeigte sich das zytoplasmatische MYC-Nick während der Mitose am Spindelapparat, MYC-CTF war während der Interphase im Zellkern und während der Mitose diffus im Zytoplasma lokalisiert. Zum direkten Nachweis der Interaktion von MYC und TPX2 wurden Immunpräzipitationen der nativen Proteine und nach Crosslinking durchgeführt, die jedoch keine direkten Bindungen nachwiesen. Die Ergebnisse sind am ehesten mit einem Modell vereinbar, in dem TPX2 und MYC an der Spindel in einem Nanomilieu ohne direkte Protein- Interaktionen vorliegen, entsprechend der für TPX2 und Tubulin aufgezeigten liquid-liquid- phase-separation. In funktionellen Analysen in vitro mit zytostatischen Substanzen zeigte sich eine verminderte Wirkung des Spindel-destabilisierenden Zytostatikums Vincristin in TPX2- und somit auch MYC-überexprimierenden Zellen. Die verminderte Suszeptibilität gegenüber Vincristin konnte durch den zusätzlichen Einsatz von Aurora-Kinase-Inhibitoren zum Teil aufgehoben werden. Zusammenfassend zeigte diese Arbeit eine funktionelle Interaktion von MYC und TPX2 auf, assoziiert mit einer Ko-Lokalisation an der mitotischen Spindel. Die Interaktion von MYC und TPX2 in der Mitose erlaubt die Entwicklung von Ansätzen zur verbesserten, MYC-gezielten Tumortherapie.
Schlagwörter: MYC; TPX2; Zellteilung; Mikrotubuli
