Einfluss parakriner Faktoren auf die neuronale Differenzierung und Regeneration
Influence of paracrine factors on neuronal differentiation and regeneration
von Carina Lehmann
Datum der mündl. Prüfung:2024-08-06
Erschienen:2024-07-24
Betreuer:Prof. Dr. Arndt Schilling
Gutachter:Prof. Dr. Arndt Schilling
Gutachter:Prof. Dr. David Liebetanz
Zum Verlinken/Zitieren:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10630
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Zusammenfassung
Englisch
The ability of an injured peripheral nerve to reinnervate its original targets is a characteristic feature of the peripheral nervous system. Axonal regeneration after injury depends on well-coordinated cellular and molecular processes. Modifying the regenerative microenvironment by adding exogenous neurotrophic factors is a promising approach to modulate and specifically improve sensory and motor regeneration after nerve injuries. This study investigated the influence of different paracrine, extracellular factors on neuronal regeneration and differentiation using the SH-SY5Y cell line. Undifferentiated SH-SY5Y cells were converted into neuron-like cells through a neuronal differentiation protocol by Forster et al. (2016). In Phase 1 (days 0-3), Vitamin A was added to DMEM High Glucose Medium, and in Phase 2 (days 3-7), the medium was switched to Neurobasal Medium with L-Glutamine, N2 supplement, and the growth factor BDNF. The differentiated SH-SY5Y cells with their long processes served as a positive control compared to the test substance. For the study, the Buffy Coat was isolated from a blood donation (Transfusion Medicine UMG Göttingen) through multiple centrifugation and washing steps. The isolated leukocytes were then cultured in hypoxia (1% O2) and normoxia (21% O2) at 37°C in 24-well plates in UltraCULTURE serum-free medium. The supernatant was collected on days 1, 3, 6, and 9 and stored at -20°C and 4°C. Subsequently, the influence of the supernatant containing growth factors on the neuronal differentiation of SH-SY5Y cells was examined. A real-time neurite growth assay in the IncuCyte S3 system was used, where SH-SY5Y cells were seeded in a 96-well plate and treated with the test substances (Buffy Coat supernatant from hypoxia/normoxia and storage conditions at -20°C and 4°C) in various concentrations (5, 10, 25, 50%). The image analysis program ImageJ with the NeuronJ plugin was used to evaluate neurite number, average neurite length, total neurite length, and neurites per cell. Neurite outgrowth was observed in a dose-dependent manner under stimulation by the addition of the Buffy Coat supernatant. The most significant effect in terms of increased total neurite length, neurite number, and neurites per cell was observed with the addition of 25-30% supernatant. There were no significant differences between 25% and 30%. The storage temperature of the supernatant at 4°C had a positive effect on neurite growth in terms of total neurite length and number. For longer storage periods, a storage temperature of -20°C and the avoidance of multiple freeze-thaw cycles is recommended. The cultivation method and collection days had no significant impact on the results of the neurite growth assays.
Keywords: paracrine factors; neuronal differentiation; neuronal regeneration; SH-SY5Y; neurite; neurite outgrowth assay; buffy coat
Deutsch
Die Fähigkeit eines verletzten peripheren Nerven, seine ursprünglichen Ziele zu reinnervieren, ist ein charakteristisches Merkmal des peripheren Nervensystems. Dabei hängt die axonale Regeneration nach der Verletzung von gut koordinierten zellulären und molekularen Prozessen ab. Hierbei ist das Modifizieren der regenerativen Mikroumgebung durch das Hinzufügen von exogenen, neurotrophen Faktoren ein vielversprechender Ansatz, um die sensorische und motorische Regeneration nach Nervenverletzungen zu modulieren und gezielt zu verbessern. Dieser Einfluss unterschiedlicher parakriner, extrazellulärer Faktoren auf die neuronale Regeneration und Differenzierung wurde im Rahmen der Studie mithilfe der SH-SY5Y-Zelllinie untersucht. Undifferenzierte SH-SY5Y-Zellen wurden durch ein neuronales Differenzierungsprotokoll nach Forster et al. (2016) zu Neuronen ähnlichen Zellen umgewandelt. In Phase 1 (Tag 0 - 3) erfolgte die Zugabe von Vitamin A zu DMEM High Glucose Medium und in Phase 2 (Tag 3 - 7) wurde auf neurobasales Medium gewechselt mit Zugabe von L-Glutamin, N2-Supplement und dem Wachstumsfaktor BDNF. Die differenzierten SH-SY5Y-Zellen mit ihren langen Fortsätzen dienten als Positivkontrolle im Vergleich zur Testsubstanz. Für die Studie wurde aus einer Blutspende (Transfusionsmedizin UMG Göttingen) der Buffy Coat durch multiple Zentrifugations- und Waschschritte isoliert. Danach wurden die isolierten Leukozyten sowohl in Hypoxie (1% O2), als auch in Normoxie (21% O2) bei 37°C in 24-Well Platten in Ultraculture serumfreiem Medium kultiviert. Der Überstand wurde jeweils an den Tagen 1,3,6,9 entnommen und bei -20°C und 4°C gelagert. Im Anschluss wurde der Einfluss des Mediumüberstandes mit den enthaltenden Wachstumsfaktoren auf die neuronale Differenzierung der SH-SY5Y Zellen überprüft. Dazu diente ein Echtzeit-Neuritenwachstumsassay im IncuCyte S3-System, indem die SH-SY5Y-Zellen in eine 96-Well-Platte ausgesät wurden und mit den Testsubstanzen (Buffy Coat Überstand Hypoxie/Normoxie und Lagerungsart bei -20°C und 4°C) in verschiedenen Konzentrationen (5, 10, 25, 50 %) behandelt wurden. Zur Auswertung der Neuritenanzahl, der durchschnittlichen Neuritenlänge, der summierten Neuritenlänge und der Neuritenanzahl pro Zelle wurde das Bildbearbeitungsprogramm ImageJ mit dem Plugin NeuronJ verwendet. Unter Stimulation durch Zugabe des Buffy Coat Überstandes konnte dosisabhängig ein Auswachsen der Neuriten beobachtet werden. Der stärkste Effekt hinsichtlich einer erhöhten summierten Neuritenlänge, Anzahl der Neuriten und Neuriten/Zelle zeigte sich bei einer Zugabe von 25-30 % Mediumüberstand. Zwischen 25 und 30 % gab es keine signifikanten Unterschiede. Die Aufbewahrungstemperatur des Mediumüberstandes zeigte bei 4°C einen positiven Effekt auf das Neuritenwachstum hinsichtlich der summierten Neuritenlänge und Anzahl. Bei einem längeren Lagerungszeitraum empfiehlt sich eine Aufbewahrungstemperatur von -20°C und das Vermeiden von multiplen Gefrier-Auftau-Zyklen. Die Kultivierungsmethode und die Entnahmetage hatten keinen signifikanten Einfluss auf das Ergebnis der Neuritenwachstumsassays.
Schlagwörter: Parakrine Faktoren; Neuronale Differenzierung; Neuronale Regeneration; SH-SY5Y; Neuriten; Neuritenwachstumsassay; Buffy Coat
