Investigation of Cells and Cellular Components with X-Rays in Liquid Sample Environments

by Jan-Philipp Burchert
Doctoral thesis
Date of Examination:2024-04-12
Date of issue:2024-08-07
Advisor:Prof. Dr. Sarah Köster
Referee:Prof. Dr. Sarah Köster
Referee:Prof. Dr. Sebastian Kruss
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10651

 

 

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Name:Dissertation_Jan-Philipp_Burchert.pdf
Size:21.7Mb
Format:PDF
Description:Dissertation

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Abstract

English

Due to their short wavelength, X-rays offer a high spatial resolution and a high ability to penetrate soft condensed matter. Therefore, X-rays are well-suited for investigating structures and structural changes in in-vitro systems as well as in intact biological cells and tissues. For such investigations, suitable sample environments need to be developed and used to avoid effects from surfaces or sample preparation. The applied sample environments need be compatible with both the sample under investigation and the X-ray radiation. In this thesis, we use small-angle X-ray scattering (SAXS) and fluorescence microscopy to investigate the assembly behavior of the muscle protein desmin into filaments in 2 mM MOPS buffer and at different KCl concentrations. Human and mouse desmin show the same assembly behavior with an optimal salt concentration of 40-50 mM KCl. The corresponding radius of gyration is approximately 5 nm. Filaments are observed in mixtures of human wild-type desmin and less than 50% of its mutant R406W; no filament formation is found above 70% R406W. To study intact cells in continuous flow, we present an X-ray compatible microfluidic chip consisting of PDMS and a capillary, which serves as both a sample delivery system and a measurement environment. As a proof-of-concept, we investigate chemically fixed bovine red blood cells (RBCs) with this device and SAXS. The comparison of the measurement results with data from established static measurement methods shows a high level of agreement and thus the reliability of the set-up for measuring cells in continuous flow. In addition, the radius of the protein hemoglobin within the RBCs is determined by fitting a hard-sphere model with screened Coulomb interactions to the data. To examine individual cells in solution with X-rays, we combine X-ray phase-contrast imaging with an X-ray compatible optical stretcher (OS) and a microfluidic sample delivery system. With this setup, individual cells can be trapped in solution and simultaneously measured with the X-ray beam. We successfully test this method on living as well as fixed and stained NIH3T3 mouse fibroblasts. Despite the need for further improvement of the staining procedure for single cells, it increases the visibility of the cell outlines and partially of the cell nuclei. A photon energy of 9.9 keV should be preferred to a photon energy of 13.8 keV for these measurements. Furthermore, rotating the cell in the OS during the acquisition enables tomography. With the help of BaSO4 markers, an algebraic 3D reconstruction scheme, and a dedicated mathematical description of the movement of the cells in the optical stretcher, we are able to calculate a 3D reconstruction. In principle, future experiments with the PDMS-capillary chip and the OS can also be used to exert forces and investigate their effects on the cell. The presented experiments show how different X-ray-based investigation methods and sample environments can be successfully combined to investigate protein conformations in chemical environments, cells in continuous flow or individual cells without the need to use surfaces or complex sample preparations.
Keywords: desmin; red blood cells; small-angle X-ray scattering; microfluidics; optical stretcher; X-ray phase-contrast tomography; cells in flow; biological cells; X-ray stain

German

Röntgenstrahlung besitzt aufgrund ihrer kurzen Wellenlänge eine hohe räumliche Auflösung und eine hohe Durchdringungsfähigkeit für weiche kondensierte Materie. Daher eignet sich Röntgenstrahlung zur Untersuchung von Strukturen und Strukturänderungen in in-vitro Systemen sowie in intakten biologischen Zellen und Geweben. Für solche Untersuchungen müssen jedoch geeignete Probenumgebungen entwickelt und verwendet werden, um Effekte von Oberflächen oder der Probenvorbereitung zu vermeiden. Solche Probenumgebungen müssen sowohl mit der Probe als auch mit der Röntgenstrahlung kompatibel sein. In dieser Arbeit verwenden wir Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) und Fluoreszenzmikroskopie, um das Assemblierungsverhalten des Muskelproteins Desmin zu Filamenten in 2 mM MOPS-Puffer und bei verschiedenen KCl Konzentrationen zu untersuchen. Menschliches und Maus-Desmin zeigen das gleiche Assemblierungsverhalten, wobei die optimale Salzkonzentration für die Bildung von Filamenten bei 40-50 mM KCl liegt. Der entsprechende Gyrationsradius beträgt etwa 5 nm. In Mischungen aus menschlichem Desmin-Wildtyp und weniger als 50% der Mutante R406W werden Filamente beobachtet; oberhalb von 70% R406W ist keine Filamentbildung zu erkennen. Zur Untersuchung von intakten Zellen in kontinuierlichem Fluss, stellen wir einen röntgenkompatiblen mikrofluidischen Chip vor, der aus PDMS und einer Kapillare besteht und der als Probenzufuhrsystem und Messumgebung dient. Zum Nachweis des Konzepts werden mit diesem Gerät chemisch fixierte rote Rinderblutzellen (RBC) mittels SAXS untersucht. Der Vergleich der Messergebnisse mit Daten von etablierten statischen Messmethoden zeigt eine große Übereinstimmung und damit die Verlässlichkeit des Aufbaus zur Messung von Zellen in kontinuierlichem Fluss. Mithilfe einer Anpassung eines Hard-Sphere-Modells mit abgeschirmten Coulomb-Wechselwirkungen and die Daten wird außerdem der Radius des Proteins Hämoglobin innerhalb der RBCs bestimmt. Um einzelne Zellen zu untersuchen, kombinieren wir Röntgen-Phasenkontrast-Bildgebung mit einem röntgenkompatiblen optischen Stretcher (OS) und einer mikrofluidischen Probenzuführung. Mit diesem Aufbau können einzelne Zellen in Lösung räumlich fixiert werden und gleichzeitig mit dem Röntgenstrahl gemessen werden. Diese Methode testen wir erfolgreich an lebenden sowie an fixierten und gefärbten NIH3T3-Mausfibroblasten. Obwohl das Färbeverfahren für einzelne Zellen weiter verbessert werden muss, erhöht es die Sichtbarkeit der Zellkonturen und teilweise der Zellkerne. Eine Strahlungsenergie von 9.9 keV ist für diese Messungen einer Strahlungsenergie von 13.8 keV vorzuziehen. Durch Rotation der Zelle im OS während der Messung wird auch Tomographie ermöglicht. Mithilfe von BaSO4 Markern, einem algebraischen 3D-Rekonstruktionsschema und einer speziellen mathematischen Beschreibung der Bewegung der Zellen im optischen Stretcher konnten wir eine 3D Rekonstruktion berechnen. Prinzipiell können in zukünftigen Experimenten mit dem PDMS-Kapillarchip und dem OS auch Kräfte auf die Zellen ausgeübt und deren Effekte auf die Zelle untersucht werden. Insgesamt zeigen unsere Experimente die erfolgreiche Kombination von verschiedenen röntgenbasierten Untersuchungsmethoden und Probenumgebungen. Dies erlaubt die Untersuchung von Proteinkonformationen in chemischen Umgebungen, Zellen in kontinuierlichem Fluss oder einzelnen Zellen ohne die Notwendigkeit Oberflächen zu verwenden und ohne aufwendige Probenvorbereitung.