Etablierung eines Protokolls zur Differenzierung in sympathische Neurone zur Untersuchung der gegenseitigen Beeinflussung von sympathischen Neuronen und Kardiomyozyten in einem induziert pluripotenten Stammzell-Modell

by Brisca Wenner
Doctoral thesis
Date of Examination:2024-10-01
Date of issue:2024-08-26
Advisor:Prof. Dr. Katrin Streckfuß-Bömeke
Referee:Prof. Dr. Katrin Streckfuß-Bömeke
Referee:Dr. Laura Zelarayan-Behrend
Sponsor:Promotionskolleg für Medizinstudierende der UMG (Else-Kröner-Fresenius-Stiftung)
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10697

 

 

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Abstract

English

Takotsubo-Syndrome (TTS) is characterized by an acute reversible dysfunction of the left ventricle. Its pathophysiology is not yet understood in its entirety. There are different hypotheses which indicate that the central autonomous nervous system and sympathetic neurons could play a role in the pathogenesis of TTS by e.g. increasing the level of norepinephrine in the blood. Additionally, a genetic predisposition is suspected. In 2017 Borchert et al. published a patient-specific induced pluripotent stem cell (iPSC) model including iPSC-cardiomyocytes (iPSC-CM) to model TTS. The aim of this work was to establish a protocol for the 2D-differentiation of iPSCs in sympathetic neurons (iPSC-symN) as well as examine the possibility of a functional 2D-co-culture of iPSC-CMs with iPSC-symNs to improve the modelling of TTS in a patient-specific-iPSC model. Control- and TTS-specific-iPSCs were differentiated in ventricular iPSC-CMs, which expressed cardiac markers on mRNA and protein levels and beat spontaneously. Three protocols for the directed differentiation of iPSCs in iPSC-symNs were tested and the best one for our cell lines was established. The differentiation in truncal neural crest cells was verified by the expression of characteristic markers PAX3, PAX7, HOXB8, FOXD3 and SOX10 on day 10 of differentiation. Matured iPSC-symNs showed the expression of characteristic markers PRPH, PHOX2B, TH and DBH. Additionally, functionality of iPSC-symNs was proven by secretion of norepinephrine after depolarisation via KCl treatment. Furthermore, generated iPSC-symNs showed a characteristic sympathetic ganglionic profile of nicotinic acetylcholine receptors (nAChR). IPSC-CMs and iPSC-symNs were successfully co-cultured, indicated by an increased beating frequency of iPSC-CMs after stimulation with a specific nAChR agonist. Further experiments are needed to confirm this. In conclusion, a protocol for the successful differentiation of iPSCs in functional iPSC-symNs was established and a possibility for the co-culture of iPSC-CMs and iPSC-symNs, in which the iPSC-symNs can be specifically stimulated, was shown. The differentiation of iPSCs in iPSC-symNs as well as the co-culture of iPSC-CMs and iPSC-symNs can be used in the future to further study the pathogenesis of TTS.
Keywords: takotsubo syndrome; induced pluripotent stem cells; sympathetic neurons; norepinephrine; cardiomyocytes; co-culture

German

Das Takotsubo-Syndrom (TTS) wird durch eine akute, reversible Dysfunktion des linken Ventrikels charakterisiert. Zur noch weitgehend ungeklärten Pathophysiologie gibt es verschiedene Theorien, die auf eine Rolle des zentralen autonomen Nervensystems und von sympathischen Neuronen hinweisen, die z. B. durch eine Er-höhung der Katecholaminkonzentration im Blut an der Pathogenese des TTS beteiligt sein können. Auch eine genetische Prädisposition wird vermutet. 2017 veröffentlichten Borchert et al. ein Patienten-spezifisches Stammzellmodell mit hiPS-KMs zur Modellierung von TTS. Ziel dieser Arbeit war es, zur besseren Krankheitsmodellierung des TTS ein Protokoll zur 2D-Differenzierung von humanen induziert pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zu sympathischen Neuronen (hiPS-symNs) zu etablieren und die Möglichkeit einer funktionellen 2D-Kokultivierung von Kardiomyozyten (hiPS-KMs) und hiPS-symNs zu untersuchen. Kontroll- und TTS-patientenspezifische hiPS-Zellen wurden gerichtet zu ventrikulären hiPS-KMs differenziert, welche auf mRNA- und Proteinebene kardiale Marker exprimierten und sich spontan kontrahierten. Es wurden drei Protokolle zur gerichteten Differenzierung von hiPSCs zu hiPS-symNs getestet und das für unsere Zelllinien geeignetste etabliert. Es wurden hierbei an Tag 10 der Differenzierung TNCs durch die Expression der charakteristischen Mar-ker PAX3, PAX7, HOXB8, FOXD3 und SOX10 der trunkalen Neuralleiste nachgewiesen. Maturierte hiPS-symNs zeigten die Expression typischer Marker wie PRPH, PHOX2B, TH und DBH. Es konnte außerdem die Funktionalität der hiPS-symNs durch eine Noradrenali-nausschüttung nach Depolarisation durch KCl aufgezeigt werden. Darüber hinaus zeigten die generierten hiPS-SymNs ein typisch sympathisch-ganglionäres nAChR-Rezeptorprofil auf. HiPS-KMs und hiPS-symNs wurden erfolgreich kokultiviert, indem die Funktionalität nach Stimulation mit dem spezifischen AChR-Agonisten zu einer erhöhten Schlagfrequenz bei den kokultivierten hiPS-KMs führte. Hier sind jedoch noch weitere Versuche nötig, um dies zu bestätigen. Zusammengefasst kann festgehalten werden, dass ein Protokoll zur erfolgreichen Differenzierung von hiPSCs in funktionelle hiPS-symNs etabliert worden ist und eine Möglichkeit zur Kokultivierung von hiPS-KMs und hiPS-symNs aufgezeigt wurde, in welcher die hiPS-symNs gezielt stimuliert werden können. Die Differenzierung von hiPSCs in hiPS-symNs und die Kokultivierung von hiPS-KMs und hiPS-symNs kann in Zukunft zur Krankheitsun-tersuchung des TTS beitragen.
Schlagwörter: Takotsubo-Syndrom; induziert pluripotente Stammzellen; sympathische Neuronen; Noradrenalin; Kardiomyocyten; Kokultur