Zur Charakterisierung des humanen Krankheitsgens SLC33A1 und dessen Homologs in Hefe

Characterization of the human disease gene SLC33A1 and its homologue in yeast

by Maria Barbara Gerards
Doctoral thesis
Date of Examination:2024-09-12
Date of issue:2024-08-28
Advisor:Prof. Dr. Blanche Schwappach-Pignataro
Referee:Prof. Dr. Blanche Schwappach-Pignataro
Referee:Prof. Dr. Peter Huppke
Referee:Prof. Dr. Thomas Meyer
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10698

 

 

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Abstract

English

A point mutation in the SLC33A1 gene leads to Huppke-Brendel syndrome, which is already lethal in early childhood. It particularly affects neurological development and is associated with significantly reduced serum copper and serum caeruloplasmin levels. It is currently known that SLC33A1 is a membrane protein of the solute carrier family. The transporter is most likely localised in the Golgi apparatus. The postulated substrate acetyl-CoA has not yet been confirmed as a physiologically relevant transport substrate. SLC33A1 is a highly conserved gene. The high sequence similarity of the yeast homologue YBR220c provides a good model for research into its function in Saccharomyces cerevisiae. In this work, I used robot-assisted crosses to search for yeast genes that lead to a growth deficit of the colonies when a gene of the yeast genome is knocked out simultaneously with the ∆ybr220c strain. ADK1 was identified as a gene that genetically interacts with YBR220c. ADK1, adenylate kinase 1, is an enzyme involved in energy metabolism. It converts ADP from ATP, particularly when energy requirements are high. I was also able to show that overexpression of YBR220c or SLC33A1 in the double mutant ∆ybr220c ∆adk1 results in a growth deficit. This enabled me to demonstrate the functional comparability of both genes. The function of YBR220c can therefore be copied in yeast cells by the human gene SLC33A1 in the case of YBR220c knock-out. This does not apply to mutations in YBR220c or SLC33A1. In a further approach, YBR220c and SLC33A1 were expressed in E. coli bacteria and inserted into the plasma membrane. In subsequent transport tests of radioactively labelled molecules, I demonstrated the substrate transport of ATP and ADP for both proteins. When testing a mutant of Huppke-Brendel syndrome, SLC33A1_A110P, there was no difference compared to the human wild type. The results of this work suggest the central role of SLC33A1 in the energy metabolism of the cell. ATP could be required for glycosylation processes, e.g. in caeruloplasmin in the Golgi apparatus or for chaperones. A function in COP vesicles of the secretory pathway, which transport chaperones specifically from the Golgi apparatus, is possible. In addition, the copper transporting ATPases ATP7A and ATP7B could be impaired by a mutation of SLC33A1 in the Golgi apparatus. These options could explain the patients' low serum copper and serum caeruloplasmin levels. For further characterization of the protein to clarify its role in disease, the next step is to clarify the conditions of the transport environment and the energy source. The purification of the human transporter and its yeast homologue with subsequent reconstitution in liposomes is suitable for this purpose. In addition, it is necessary to rule out the previously described substrate, acetyl-CoA, by reproducing previous transport experiments and repeating the E. coli experiments with radioactively labeled acetyl-CoA. Further analysis of the structure of SLC33A1 is also an important aspect of its characterization.
Keywords: SLC33A1; YBR220c; Huppke-Brendel syndrome; ATP; Secretory pathway

German

Eine Punktmutation im Gen SLC33A1 führt zum Huppke-Brendel-Syndrom, welches bereits im frühen Kindesalter letal verläuft. Es betrifft insbesondere die neurologische Entwicklung. Auffällig sind deutlich erniedrigte Serum-Kupfer- und Serum-Caeruloplasmin-Spiegel. Bisher ist bekannt, dass es sich bei SLC33A1 um ein Membranprotein der Familie der Solute Carrier handelt. Der Transporter ist am ehesten im Golgi-Apparat lokalisiert. Das postulierte Substrat Acetyl-CoA wurde bisher nicht final als physiologisch relevantes Transportsubstrat bestätigt. SLC33A1 ist ein hochkonserviertes Gen. Durch die hohe Sequenzähnlichkeit des Hefehomologs YBR220c wird ein gutes Modell für die Erforschung seiner Funktion in Saccharomyces cerevisiae ermöglicht. In dieser Arbeit habe ich durch robotergestützte Kreuzungen solche Hefegene gesucht, die bei gleichzeitigem Knock-out eines Gens des Hefegenoms mit dem ∆ybr220c-Stamm zu einem Wachstumsdefizit der Kolonien führen. ADK1 wurde als ein mit YBR220c genetisch interagierendes Gen nachgewiesen. ADK1, die Adenylatkinase 1, ist ein Enzym im Energiestoffwechsel. Insbesondere bei hohem Energiebedarf stellt es ATP aus ADP bereit. Zudem konnte ich zeigen, dass bei Überexpression von YBR220c bzw. SLC33A1 in der Doppelmutante ∆ybr220c ∆adk1 ein Wachstumsdefizit vorliegt. So konnte ich eine funktionelle Vergleichbarkeit beider Gene darstellen. Die Funktion von YBR220c kann also in Hefezellen durch das menschliche Gen SLC33A1 bei YBR220c-Knock-out kopiert werden. Dies gilt nicht bei Mutationen in YBR220c bzw. SLC33A1. In einem weiteren Ansatz wurden YBR220c und SLC33A1 in Bakterien der Art E. coli exprimiert und in die Plasmamembran inseriert. Bei anschließenden Transport-Tests radioaktiv markierter Moleküle habe ich den Substrattransport von ATP und ADP für beide Proteine gezeigt. Bei der Testung einer Mutante des Huppke-Brendel-Syndroms, SLC33A1_A110P, ergab sich hierbei kein Unterschied im Vergleich zum menschlichen Wildtyp. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen die zentrale Rolle von SLC33A1 im Energiestoffwechsel der Zelle nahe. ATP könnte bei Glykosylierungsvorgängen z. B. an Caeruloplasmin im Golgi-Apparat oder für Chaperone nötig sein. Eine Funktion in COP-Vesikeln des sekretorischen Pfads, die Chaperone speziell aus dem Golgi-Apparat befördern, ist denkbar. Zudem könnten die Kupfer transportierenden ATPasen ATP7A und ATP7B durch eine Mutation von SLC33A1 im Golgi-Apparat beeinträchtigt sein. Diese Optionen könnten die erniedrigten Serum-Kupfer- und Serum-Caeruloplasminspiegel der Patient*innen erklären. Zur weiteren Charakterisierung des Proteins auf dem Weg zur Krankheitsaufklärung müssen im nächsten Schritt die Bedingungen des Transport-Milieus und die Energiequelle geklärt werden. Hierfür eignet sich die Aufreinigung des humanen Transporters und dessen Hefehomologs mit anschließender Rekonstitution in Liposomen. Zudem ist ein weiterer Ausschluss des bisher beschriebenen Substrats, Acetyl-CoA, durch Reproduktion bisheriger Transportversuche und Wiederholung der E. coli-Experimente mit radioaktiv markiertem Acetyl-CoA nötig. Auch die weitere Analyse der Struktur von SLC33A1 ist ein wesentlicher Punkt dessen Charakterisierung.
Schlagwörter: SLC33A1; YBR220c; Huppke-Brendel-Syndrom; ATP; Sekretorischer Pfad