Investigation of the fusion machinery reconstituted into novel pore-spanning membranes

by Merve Sari
Doctoral thesis
Date of Examination:2024-05-15
Date of issue:2024-09-06
Advisor:Prof. Dr. Claudia Steinem
Referee:Prof. Dr. Claudia Steinem
Referee:Prof. Dr. Michael Meinecke
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10719

 

 

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Abstract

English

The release of neurotransmitter into the synaptic cleft is achieved by fusion of synaptic vesicles with the presynaptic membrane. This essential process in the neuronal signal transmission is driven by the soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment receptor (SNARE) proteins to overcome the repulsive forces of the membranes. To analyze the fusion process in vitro, pore-spanning membranes (PSMs) are an appropriate model system to mimic the presynaptic membrane and incorporate the target-SNAREs. PSMs have a mobile freestanding part with an underlying compartment for content release. Therefore, it is crucial to achieve a high protein reconstitution efficiency (here ΔN49 complex) in giant unilamellar vesicles (GUVs) used as precursors of PSMs. Two different methods were used to reconstitute the ΔN49 complex in this work: lipid-based microfluidics and electroformation. In lipid-based microfluidics, droplet-stabilized GUVs (dsGUVs) are formed within a surfactant shell. These dsGUVs are then destabilized by a de-emulsifier and released into a physiological surrounding. In this study, three fusion-related proteins varying in structural complexity (ΔN49 complex, synaptobrevin 2, and the transmembrane domain of syntaxin 1A (syx 1A-TMD)) were successfully reconstituted in dsGUV, as demonstrated by lipid and protein mobility determined by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) measurements. The results showed that the ΔN49 complex and syx 1A-TMD had a heterogeneous distribution in the membrane, with a reconstitution efficiency of ~50% for both. This thesis suggests that during the release process, the surfactant layer and de-emulsifier electrostatically interact with lipid and protein molecules leading to lipid and protein leakage. The syx 1A-TMD containing GUVs were successfully released and homogeneously distributed in the lipid membrane due to the absence of an extracellular part to interact with. Confocal microscopy detected the successful formation of PSMs containing Syx 1A-TMD. Thus, a novel reconstitution process was established that starts with proteoliposomes and ends with proteo-PSMs under physiological conditions. In a second context, reliable GUV spreading was established on porous substrates with closed cavities, forming osmolarity-dependent curved PSMs. However, a tight membrane arrangement of the PSMs was demonstrated due to dye entrapment in the underlying compartment. The PSMs were doped with a labeled ΔN49 complex and the mobility of lipid and protein was characterized. Single vesicle fusion assays were performed by adding content-labeled (sulforhodamine B) synaptobrevin 2-doped LUVs to these partially curved PSMs to gain further insight into the different stages of the fusion pathway. First, the diffusion behavior of docked vesicles on PSMs was investigated. The simultaneous observation of lipid mixing and content release allowed the identification of flickering fusion pore opening and closing. This allowed conclusions to be drawn about the different stability and regression kinetics of the Ω-shaped post-fusion structure. Finally, the influence of curved PSMs on the release kinetics was determined.
Keywords: PSMs; GUVs; SNARE proteins; Microfluidics; Membrane fusion

German

Die Freisetzung von Neurotransmittern in den synaptischen Spalt erfolgt durch Fusion der synaptischen Vesikel mit der präsynaptischen Membran. Dieser Prozess in der Signalweiterleitung wird von den SNARE (N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment receptor)-Proteinen angetrieben, um die abstoßenden Kräfte zwischen den Membranen zu überwinden. Um den Fusionsprozess in vitro zu analysieren, sind porenüberspannende Membranen (PSMs) ein geeignetes Modellsystem, das die präsynaptische Membran nachahmt. PSMs haben einen beweglichen, freistehenden Teil mit einem darunter liegenden Kompartiment für die Freisetzung von Ladungen. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, eine hohe Effizienz bei der Rekonstitution von Proteinen (hier des ΔN49-Komplexes) in unilamellaren Riesenvesikeln (GUVs) als Vorläufer von PSMs zu erreichen. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Methoden zur Rekonstitution des ΔN49-Komplexes verwendet: lipidbasierte Mikrofluidik und Elektroformation. Bei der lipidbasierten Mikrofluidik werden tröpfchenstabilisierte GUVs (dsGUVs) innerhalb einer Tensidhülle (TH) gebildet. Diese dsGUVs werden dann durch einen De-Emulgator (DE) destabilisiert und in eine physiologische Umgebung freigesetzt. In dieser Studie wurden drei fusionsbezogene Proteine mit unterschiedlicher struktureller Komplexität (ΔN49-Komplex, Synaptobrevin 2 (Syb 2) und die Trans-membrandomäne von Syntaxin 1A (Syx 1A-TMD)) erfolgreich in dsGUVs rekonstituiert. Dies wurde anhand der Lipid- und Proteinmobilität durch FRAP-Messungen gezeigt. Die Ergebnisse zeigten, dass der ΔN49-Komplex und Syx 1A-TMD eine heterogene Ver-teilung in der Membran aufwiesen, mit einer Rekonstitutionseffizienz von ~50% für beide. Während des Freisetzungsprozesses findet eine elektrostatische Wechselwirkung zwischen der TH und dem DE mit Lipid- und Proteinmolekülen statt. Infolgedessen wurden die Syx 1A-TMD enthaltenden GUVs erfolgreich freigesetzt und ihre homogene Verteilung in der Lipidmembran nachgewiesen, da kein extrazellulärer Teil vorhanden war, mit dem sie interagieren konnten. Durch konfokale Mikroskopie konnte die erfolgreiche Bildung von PSMs, die Syx 1A-TMD enthalten, nachgewiesen werden. Damit ist ein neuartiger Rekonstitutionsprozess etabliert, der mit Proteoliposomen beginnt und mit Proteo-PSMs unter physiologischen Bedingungen endet. Weiterhin wurde ein GUV-Spreiten auf Substraten mit geschlossenen Kavitäten etabliert, das osmolaritätsabhängig gekrümmte PSMs bildet. Dichte PSMs konnten aufgrund des Farbstoffeinschlusses im darunter liegenden Kompartiment nachgewiesen werden. Die PSMs wurden mit einem markierten ΔN49-Komplex dotiert und dabei die Mobilität von Lipiden und Proteinen charakterisiert. Um weitere Einblicke in die verschiedenen Stadien des Fusionsprozesses zu gewinnen, wurden Sulforhodamin B gefüllte Syb 2-LUVs zu den PSMs gegeben. Zunächst wurde das Diffusionsverhalten der angedockten Vesikel auf PSMs untersucht. Die gleichzeitige Beobachtung der Lipidmischung und der Freisetzung des Inhalts ermöglichte die Identifizierung des Öffnens und Schließens der Fusionsporen. Dies erlaubte Rückschlüsse über die unterschiedliche Stabilität und Regressionskinetik der Ω-förmigen Postfusionsstruktur. Schließlich wurde der Einfluss von gekrümmten PSMs auf die Freisetzungskinetik untersucht.